目的应用酵母双杂交法检测人乳头瘤病毒16型（HPV16）E6蛋白与hDaxx的相互作用,并初步探讨其相互作用对凋亡的影响,为进一步研究E6蛋白在HPV16致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法⑴pGADT7/E6重组体的构建:采用Primer Premier5.0软件设计特异性引物,并引入EcoRI和BamHI酶切位点,PCR扩增HPV16 E6基因。用EcoRI和BamHI分别双酶切PCR产物和质粒pGADT7,纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。对重组质粒进行酶切鉴定及序列分析。⑵pGBKT7/hDaxx重组体的构建:用EcoRI和SalI分别双酶切pGBDU-C1/hDaxx和pGBKT7,分别纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,筛选到阳性克隆后,对重组质粒行酶切鉴定。⑶酵母双杂交检测E6蛋白与hDaxx的相互作用:分4组共转化酵母菌AH109,A组为pGADT7和pGBKT7,B组为pGADT7/E6和pGBKT7/hDaxx,C组为pGADT7/T和pGBKT7/Lam,D组为pGADT7/T和pGBKT7/p53。将转化菌分别接种于SD/-Trp-Leu（二缺陷）固体培养基,30℃培养2～4d,待平板上长出单个菌落后,再将该菌落接种于SD/-Trp-Leu-His（三缺陷）和SD/-Trp-Leu-His-Ade（四缺陷）平板,30℃培养2～4d,观察酵母菌的生长情况。裂解B组四缺陷平板上的酵母菌,提取蛋白质,经Western blot检测E6蛋白和hDaxx在酵母菌中的表达。⑷流式细胞术检测凋亡:分别将0μg、10μg、20μg、30μg的pcDNA3.1（-）/hDaxx和10μg pcDAN3.1（-）/E6瞬时共转染Hela细胞,以pcDNA3.1（-）转染组和空细胞组作为对照。5-FU处理36h后分别收集各组细胞,经75%的乙醇4℃固定过夜,PI染色后,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。用统计软件SPSS13.0分析实验数据。结果⑴pGADT7/E6重组体的构建:重组质粒经双酶切及测序分析,所克隆的目的片段与GenBank上公布的HPV16 E6基因（Pubmed NC₀01526）序列一致。⑵pGBKT7/hDaxx重组体的构建:重组质粒经双酶切鉴定,得到了与预期大小一致的约2.2kb的条带。⑶E6蛋白和hDaxx相互作用的检测:4个组的二缺陷平板上均可长出白色菌落,但接种到三缺陷和四缺陷平板后,只有B组、D组转化菌可以生长,A组、C组未见菌落生长。提取B组四缺陷平板上的酵母蛋白,经Western blot检测到E6蛋白和hDaxx的表达。⑷凋亡率的检测:各组Hela细胞经5-FU处理后,流式细胞术测得,pcDAN3.1（-）/E6转染组细胞凋亡率明显低于pcDNA3.1（-）转染组和空细胞组,结果差异具有统计学意义（P<0.01）。共转染pcDNA3.1（-）/E6和pcDNA3.1（-）/hDaxx的Hela细胞,随pcDNA3.1（-）/hDaxx转染量的增加,凋亡率有所上升。结论⑴成功地构建了pGADT7/E6和pGBKT7/hDaxx酵母菌真核表达载体,并可在酵母菌AH109中表达。⑵HPV16 E6与hDaxx在酵母细胞内发生相互作用。⑶HPV16 E6蛋白可抑制5-FU诱导的Hela细胞凋亡;在表达E6蛋白的Hela细胞中,hDaxx的过高表达促进5-FU诱导的凋亡。