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目的:通过长波紫外线(Ultraviolet A)反复照射人皮肤成纤维细胞建立细胞光损伤模型,将富自体浓缩生长因子(Concentrated Growth Factors,CGF)用于细胞光损伤模型中。探讨CGF对长波紫外线照射后成纤维细胞的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、细胞增殖与迁徙的影响。方法:1.人皮肤成纤维细胞的培养及鉴定切取河北医科大学第三医院的患者正常背部皮肤组织,患者年龄在25-30岁之间。本研究经河北医科大学口腔医院伦理委员会批准。组织块培养法原代培养。取第三代的细胞,采用鼠抗人波形蛋白单克隆抗体、鼠抗角蛋白单克隆抗体、Ⅲ型胶原多克隆抗体对细胞进行鉴定。2.CGF培养液制备用专用绿色真空采血管采取志愿者的静脉血,立即置入Medifuge离心机中,经过离心处理后,吸管吸出液态CGF。CGF经冷冻与过滤处理后,加入细胞培养液(10%胎牛血清和90%DMEM)配制成4种浓度CGF完全培养液:5%、10%、15%和20%。3.UVA处理取对数生长期的成纤维细胞,使用光谱范围为320-400 nm UVA台式仪、以照射剂量为18J/cm~2对成纤维细胞进行照射,常规细胞培养24h、48h、72h后MTT法分别对正常和照射细胞的吸光度值进行检测,确定成纤维细胞光损伤。4.CGF应用浓度筛选细胞照射后,分别向照射后的细胞加入5%、10%、15%和20%的CGF完全培养液和细胞培养液培养,分别于24h、48h、72h,使用MTT法在490 nm波长条件下分别对各组细胞的吸光度值进行检测。各浓度组设7个平行试样,计算各组吸光度均值(以x±s表示)。确定CGF应用浓度。5.实验分组对照组:不接受UVA照射、常规细胞培养液培养。光损伤组:以照射剂量为18J/cm~2的UVA对成纤维细胞进行照射,常规细胞培养液培养。CGF处理组:以照射剂量为18J/cm~2的UVA对成纤维细胞进行照射,5%CGF完全培养液培养。6.检测含有活性氧簇的细胞量采用DCFH-DA对各组细胞进行标记,荧光显微镜暗视野下对含有ROS的细胞随机拍摄计数,具体操作按ROS试剂盒操作说明进行。7.细胞SOD活力检测三组成纤维细胞培养24h,取三组细胞的培养上清液,采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定SOD活力。具体操作过程按照南京建成生物工程研究所生产的超氧化物歧化酶试剂盒操作说明进行。所有的数据用每毫升SOD单位活力(U/ml)表示。8.划痕实验在3组细胞培养达到90-100%的融合后,用20ul移液管末端在细胞培养板形成划痕。继续培养24、48、72、96h,观察成纤维细胞迁移至划痕区,并拍照测量。用划痕试验来测量成纤维细胞的迁移能力。9.统计学分析应用SPSS 21.0软件进行统计学分析,应用单因素方差分析和SNK-t检验比较三组数据,P<0.05有统计学意义。结果:1.人皮肤成纤维细胞的培养及鉴定原代培养5-7天后,细胞从组织块中迁移出,长梭形,2-3个突起,胞体丰满,胞浆均匀,胞核圆或卵圆形,核仁大。9-13天后,细胞在组织块中心周围成放射状。当细胞融合率达到70-80%时,细胞进行传代培养。取第3代细胞进行免疫组织化学鉴定:抗III型胶原和抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性,确定为人皮肤成纤维细胞。2.成纤维细胞光损伤的确定24h、48h、72h,光损伤组与对照组的OD值有统计学差异(P<0.05),表明18J/cm~2的UVA照射剂量可对成纤维细胞造成光损伤。3.最适CGF浓度筛选24h、48h,5%CGF浓度组与其他各组的OD值均有统计学差异(P<0.05),5%CGF浓度组OD值最高。确定5%为CGF应用浓度。4 CGF对UVA处理成纤维细胞的细胞存活率影响CGF培养24h后,两组细胞存活率均值(以x±s表示):光损伤组,0.4482±0.0603;CGF处理组,0.601±0.035;两组吸光度值有统计学意义(P<0.05)。CGF培养48h后,两组细胞吸光度均值(以x±s表示):光损伤组,0.6748±0.0918;CGF处理组,0.7457±0.2513;两组吸光度值之间均有统计学意义(P<0.05)。5.CGF减少了UVA照射后含ROS的细胞量对照组、光损伤组、CGF处理组含ROS细胞数量分别为:3.3333±1.8028、65.5556±3.3582、22.7778±2.4381,具有统计学意义(P<0.05)。6.细胞SOD活力检测每组含SOD单位活力(以x±s表示):光损伤组,CGF处理组和对照组的SOD(U/ml)分别为22.4725±1.2656,31.8462±2.3332,37.1833±2.5315;三组SOD(U/ml)有统计学意义(P<0.05)。7.划痕实验加入CGF培养24h,三组细胞迁徙率(以x±s表示):光损伤组,CGF处理组和对照组的迁徙率分别为2.35±0.84%,74.9±3.17%,62.07±4.23%;三组细胞迁徙率值有统计学意义(P<0.05)。结论:1.UVA照射可对成纤维细胞造成光损伤。2.CGF可提高光损伤成纤维细胞的SOD含量、降低ROS含量,对UVA照射所致成纤维细胞光损伤具有一定的抑制作用。3.CGF可提高光损伤成纤维细胞活性,具有一定的促增殖、迁徙作用。