血管新生(Angiogenesis)是实体肿瘤发生、发展过程中必不可少的关键过程,因此目前抗血管生产已经成为肿瘤治疗的重要策略。由于血管生成过程主要受血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)及其受体(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,VEGFR)的精细调控,因而抗血管生成策略包括使用针对VEGF和VEGFR的细胞外抑制剂(例如中和抗体)和针对VEGFR的细胞内抑制剂(例如小分子抑制剂)。阿帕替尼是我国自主研发的一种新型高选择性VEGFR2抑制剂,可阻断VEGFR2在细胞水平的下游信号转导,对多种实体瘤具有良好抗肿瘤活性。肺癌是世界上发生率及死亡率均位列第一的恶性肿瘤。针对具有某些突变的患者的靶向治疗,特别是通过使用靶向表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs),为患者提供了显着的益处。然而,在治疗过程中产生的耐药逐渐成为TKIs临床应用的瓶颈,因此成为亟待解决的问题。紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是治疗非小细胞肺癌常用的化疗药物,然而紫杉醇在临床使用过程中也较易产生多药耐药(Multidrug resistance,MDR),这仍然是化疗药物治疗非小细胞肺癌患者的主要挑战。研究表明,药物外排、药物靶点突变等诸多因素可能导致肿瘤对化疗药物产生多药耐药,其中ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC)的过表达是介导药物外排的最重要方式。在ABC转运蛋白中,ABCB1蛋白是被广泛研究的,也是介导紫杉醇多药耐药的最重要蛋白之一。我们的主要研究内容和结果包括:(1)在这里,我们发现阿帕替尼可以有效抑制获得性吉非替尼耐药肺癌细胞的增殖,且抑制作用明显强于其对其亲本细胞的作用。通过用吉非替尼持续诱导(12个月)亲本敏感细胞株PC9,我们成功构建了吉非替尼获得性耐药肺癌细胞系PC9GR。已报到EGFR-TKI获得性耐药的主要机制是T790M突变。我们观察到PC9GR耐药细胞获得了T790M突变。用不同浓度的阿帕替尼处理肺癌亲本细胞PC9、肺癌吉非替尼耐药细胞株PC9GR、肺癌A549细胞及H460细胞,观察阿帕替尼对其增殖作用的影响,我们发现与PC9、A549、H460细胞相比,阿帕替尼对PC9GR细胞的增殖抑制作用明显强于其余组(大约5倍)。阿帕替尼这种抑制作用,主要通过阻滞PC9GR细胞周期G1期实现的。用相同浓度阿帕替尼处理PC9细胞,PC9GR细胞后,进行mRNA测序以检测差异表达的基因和涉及的信号通路改变。mRNA测序结果在PC9GR细胞中显示出多种信号通路的改变,改变最明显的信号通路富集在细胞周期信号通路和DNA复制中,其中信号通路中大多数基因活性被抑制,而PC9细胞没有发现明显的上述信号通路改变。使用免疫蛋白印迹检测关键细胞周期调节因子p57、p27、CDK2及细胞周期蛋白E2和pRb蛋白的表达。我们发现,在PC9GR细胞中,阿帕替尼显著下调CDK2蛋白、细胞周期蛋白E2和pRb蛋白的表达,上调p57蛋白的表达。最后,我们用小鼠移植瘤模型评估阿帕替尼在体内的抗肿瘤活性。与PC9细胞相比,口服阿帕替尼对PC9GR细胞在小鼠模型中的增殖具有更强的抑制作用。阿帕替尼治疗后小鼠模型肿瘤中的磷酸化VEGFR2表达和微血管形成明显降低。(2)阿帕替尼是一种新型血管内皮生长因子受体抑制剂,并且能够抑制ABCB1蛋白的转运功能。本部分研究旨在探讨阿帕替尼对肺癌A549细胞的紫杉醇耐药细胞株(A549/PTX)逆转耐药作用及相关机制。在这里我们成功构建了肺癌A549紫杉醇耐药细胞A549/PTX。与A549细胞相比,A549/PTX细胞对紫杉醇具有显著的耐药性,免疫蛋白印记显示ABCB1蛋白高表达。我们单独用阿帕替尼,单用紫杉醇或紫杉醇联合阿帕替尼处理A549/PTX细胞。通过CCK8法测量细胞生存率。我们发现阿帕替尼明显增加了紫杉醇对A549/PTX细胞的细胞毒性。通过流式细胞仪测定细胞凋亡率、细胞周期分布、细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的生成和罗丹明在细胞内蓄积水平。我们发现,阿帕替尼显著增加了紫杉醇诱导的A549/PTX细胞凋亡、细胞周期G2/M期阻滞并激活细胞内ROS生成。通过超高效液相色谱法(Ultra high performance liquid chromatography,UPLC)测量细胞内紫杉醇浓度,我们发现,阿帕替尼处理导致A549/PTX细胞内紫杉醇的浓度明显增加。蛋白质印迹结果显示,阿帕替尼和紫杉醇联合应用,主要通过抑制AKT和ERK信号通路抑制A549/PTX细胞增殖。