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目的:嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum,AP）是一种经蜱传播的致病菌,可侵染人和动物的中性粒细胞引起致死性疾病。在我国,自2006年发现此病原菌感染的首例患者以来,感染人数逐年上升。近年来,针对嗜吞噬细胞无形体感染的调查很多,但是对于苏州地区的调查却鲜有报道。本文根据嗜吞噬细胞无形体16s rRNA基因片段和MSP3蛋白核苷酸序列设计特异性引物,使用PCR方法扩增了苏州宠物医院收集的犬血样品,调查了该地区犬感染情况,为本地区嗜吞噬细胞无形体感染的预防和控制提供流行病学资料。嗜吞噬细胞无形体侵染和致病过程当中,其IV型分泌系统（Type IV secretion system,T4SS）的效应分子蛋白起着关键作用。本文利用生物信息学分析了嗜吞噬细胞无形体IV型分泌系统潜在效应分子的基本理化性质和结构特征,通过原核表达系统表达并纯化了重组蛋白,制备了针对潜在效应分子的多克隆抗体;并根据生物信息学分析挑选两种潜在效应分子克隆到真核表达载体中后转染HeLa细胞,探究潜在效应分子在真核细胞中的分布。通过上述研究为嗜吞噬细胞无形体效应分子的筛选、鉴定和功能研究奠定了基础。方法:一、嗜吞噬细胞无形体感染的分子生物学调查1.犬血基因组提取。取犬血利用血基因组提取试剂盒提取DNA,-20℃保存备用。2.苏州地区犬感染嗜吞噬细胞无形体的分子生物学调查。按照嗜吞噬细胞无形体16s rRNA和MSP3蛋白基因片段为靶基因设计引物,探究其最佳反应条件后,通过巢式PCR扩增DNA样品。并将筛选的阳性样本使用柠檬酸合成酶基因和MSP4蛋白基因为扩增靶基因序列利用PCR方法加以验证。阳性样品PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后,克隆进pUCm-T载体,并转化进Top10感受态细胞中。挑选阳性克隆菌落,过夜培养后,提取质粒送至公司测序,将测序得到的核苷酸序列与Gene-Bank中已知的序列对比。二、嗜吞噬细胞无形体潜在效应分子的生物信息学分析在Gene-Bank中查找所要分析的潜在效应分子核苷酸序列,使用ORF Finder来推导其开放阅读框。1.利用ProtParam程序分析预测潜在效应蛋白的氨基酸序列、理论等电点、疏水性、消光系数、半衰期、不稳定系数等理化性质。2.利用生物信息学在线软件分析前体蛋白氨基酸序列,包括信号肽、跨膜区、抗原位点、磷酸化位点和亚细胞定位等。3.利用生物信息学在线软件预测分析潜在效应分子蛋白结构。三、嗜吞噬细胞无形体潜在效应分子的原核表达1.原核表达载体的构建。根据潜在效应分子核苷酸序列设计引物,PCR扩增后纯化,并用核酸内切酶双酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳纯化后,连接到原核表达载体上。APH0832、APH0833、APH0847、APH1067连接到pET-28a（+）上,APH0723、APH0907、APH0919连接到pGEX-4T-1上。将重组质粒转化进DH5α感受态细胞中,过夜培养后菌落PCR挑选阳性克隆单菌落;挑取阳性菌落过夜培养,提取质粒送至公司测序。将测序成功重组的质粒转化进BL21（DE3）感受态细胞中表达。2.重组蛋白的诱导表达。将上述含有重组质粒的BL21（DE3）接种到液体培养基,过夜培养后1:100稀释到200 ml培养基中,3.5 h后加IPTG诱导表达,4 h后4℃离心。3.重组蛋白的纯化。将上述离心的菌体重悬,超声破碎,SDS-PAGE检测重组蛋白在菌体中分布。根据重组蛋白所分布的位置作破碎处理,离心后使用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析或Ni2+亲和层析色谱法纯化重组蛋白,SDS-PAGE检测纯化效果。4.多克隆抗体的制备。利用SDS-PAGE纯化上述重组蛋白,切下目的条带并研磨,加入佐剂后混合均匀,定期腹腔注射免疫小鼠。第6周剪尾检测抗体滴度,第7周心脏取血,离心取上清。5.Western Blot检测多克隆抗体的特异性。四、嗜吞噬细胞无形体潜在效应分子的真核表达1.真核表达载体的构建。根据APH0919和APH1067核苷酸序列设计引物,PCR扩增产物纯化后用核酸内切酶双酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳纯化后连接到真核表达载体p-EGFP-N1上。将重组质粒转化进DH5α感受态细胞中,培养12 h后做菌落PCR,挑选阳性克隆,并提取质粒进行测序,结果与Gene-Bank上序列对比。2.重组蛋白的真核表达。将上述克隆的重组质粒转染进入HeLa细胞中,72 h后在荧光显微镜下观察重组蛋白在细胞中的分布。结果:一、嗜吞噬细胞无形体感染的分子生物学调查将测序结果与Gene Bank中序列对比。结果显示,阳性样品核苷酸序列为嗜吞噬细胞无形体16s rRNA和MSP3蛋白核酸序列。PCR扩增柠檬酸合成酶基因和主要膜蛋白MSP4基因的结果与预期相符。此次调查,共测得犬血样品223份,其中阳性样品7份,感染率为3.14%。二、嗜吞噬细胞无形体潜在效应分子的生物信息学分析利用生物信息学软件预测分析了七种潜在效应分子的理化性质、前体蛋白氨基酸序列、潜在效应分子蛋白结构,并将预测结果加以对比,选取APH0919和APH1067进行真核表达,以进一步研究。三、嗜吞噬细胞无形体潜在效应分子的原核表达及抗体制备1.原核表达载体的构建。重组质粒测序结果分析显示,已成功制备原核表达载体。2.重组蛋白的纯化。含重组质粒的细菌经IPTG诱导表达后,可溶性分析发现APH0832、APH0833、APH0847、APH1067、APH0907存在于包涵体中,APH0723、APH0919存在于细胞质中。纯化后SDS-PAGE检测结果显示:APH0832、APH0833、APH0847、APH0907、APH0919、APH1067条带均能与预期结果相符,得到较纯的重组蛋白,而APH0723易分解而纯化效果不佳。3.多克隆抗体的制备和检测。将重组蛋白腹腔注射小鼠,7周心脏取血,Western Blot检测小鼠多克隆抗体。结果显示,APH0833、APH0907、APH0919制得特异性较高的抗体,APH0832、APH0847、APH1067制得的抗体出现多条非特异性条带,需进一步进行抗体纯化。四、嗜吞噬细胞无形体潜在效应分子的真核表达1.真核表达载体的构建。重组质粒测序显示,已成功制备真核表达重组载体。2.重组蛋白的真核表达。荧光显微镜观察,潜在效应分子在HeLa细胞中呈颗粒状不规则的分布。Western Blot检测显示,重组蛋白在He La细胞成功表达。结论:1.通过嗜吞噬细胞无形体感染的分子生物学调查,共筛选到7份阳性犬血,感染率为3.14%,为本地区嗜吞噬细胞无形体感染的预防和控制提供流行病学资料。2.通过生物信息学在线软件,预测分析了潜在效应分子的基本理化性质、结构,为嗜吞噬细胞无形体IV型分泌系统效应分子的筛选提供了依据。3.构建了原核表达载体,成功表达并纯化出重组蛋白,并制备了多克隆抗体,为嗜吞噬细胞无形体IV型分泌系统效应分子的鉴定研究提供了工具。4.构建了真核表达载体,探究了APH0919和APH1067两种潜在效应分子在HeLa细胞中的分布,为潜在效应分子功能的研究奠定了基础。