当前无论在恶性肿瘤的发病率还是死亡率中,肺部恶性肿瘤均居首位。在临床工作中手术、化疗、放疗仍是其主要的治疗手段,但治疗后的生存率和预后仍很不理想。树突状细胞(Dendritic cell, DC)是目前体内的抗原呈递能力最强大的细胞,具有诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte CTL)生成的能力。有研究表明恶性肿瘤的发生、发展及预后均与树突状细胞有一定关系。自身免疫逃逸是恶性肿瘤的发生的重要机制之一,其主要原因是因为DC细胞数量在瘤内及瘤旁组织中减少从而导致DC无法递呈肿瘤相关抗原、激活细胞毒性T淋巴细胞,诱导特异性免疫反应杀伤肿瘤细胞。因此我们认为,DC细胞在肺恶性肿瘤细胞的免疫逃逸机制中亦起到关键作用。肿瘤疫苗或肿瘤免疫治疗的基本原理是通过体外或体内给予患者肿瘤抗原来激发患者的被动或主动的免疫反应,从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。疫苗具备治疗特异性强,且在一定时间段内具有记忆性等优点,可以有效的预防肿瘤的复发或转移。当前,以DC细胞为载体制备的肿瘤疫苗,从而诱导精准的抗肿瘤的免疫治疗已成为肿瘤治疗的研究热点。同时,细胞免疫治疗较常规的放化疗的毒副作用小,对正常细胞及器官损伤降到最低。而细胞免疫治疗的关键是其精准地靶向治疗,既通过肿瘤特异性的抗原作为信号,从而诱发CTL效应。作为外来抗原肿瘤抗原具有免疫原性低的特点,但其识别是特异性细胞免疫治疗的基础。所以选择适合的肿瘤相关抗原成为精准肿瘤免疫治疗的关键。细胞角蛋白(Cytokeratin, CK)广泛存在于上皮癌的细胞中,为细胞骨架的组分之一。CK分子具有至少20个不同的亚型(CK1～CK20),其中CK19蛋白在上皮性癌细胞的表达最为特异,细胞角蛋白19(CK19)片段在恶性肿瘤诊断中最为重要,这也使得CK19成为肿瘤检测及细胞免疫治疗的可能靶点。在第一部分中我们通过实验证实CK19蛋白在Lewis肺癌细胞中表达增高,说明CK19蛋白在肺癌的发生中起到重要作用,CK19蛋白可以作为肿瘤细胞免疫治疗的靶向抗原,同时证明Lewis肺癌细胞可以作为CK19靶向性免疫治疗的细胞,其可用于体内和体外研究。因此我们选择CK19作为肺癌细胞免疫治疗的靶点具有十分良好的前景。目前于体外获取和培养DC细胞的技术口趋成熟,于体外通过将肿瘤抗原相关基因或抗原转入DC细胞中,从而制备肿瘤特异性疫苗越来越受到人们的关注和认可。通过重组腺病毒载体将目的基因转入DC细胞中是当前制备肿瘤免疫疫苗的最有效的方法,而构建含有靶向基因的重组腺病毒是转染DC细胞制备疫苗的前提条件。AdMax系统是目前制备重组腺病毒最为高效的方法之一,在我们实验设计的第二部分中,我们即利用通过AdMax系统构建携带肺癌靶向基因CK19的重组腺病毒。经过测序鉴定成功构建重组腺病毒后,在实验的第三及第四部分分别将含有肿瘤靶向基因CK19基因的重组腺病毒(rAd-CK19)转染DC细胞后,检测DCs细胞表型变化,及CK19蛋白表达情况,确定制备成功rAd-CK19-DCs疫苗。在转染成功后将DC疫苗免疫接种到Lewis肺癌小鼠模型中,通过检测肿瘤体积及重量的变化来评价人工肿瘤免疫疫苗在抗Lewis肺癌中的治疗效果。第一部分检测小鼠Lewis肺癌细胞中CK19的表达[研究目的]第一部分拟通过实验证实CK19mRNA及蛋白可以作为细胞免疫治疗的靶向基因或抗原,同时证明Lewis肺癌细胞可以作为CK19靶向免疫治疗的实验细胞。[研究方法]通过PCR法检测Lewis肺癌细胞CK19 mRNA的表达,证明CK19在肺癌细胞中高表达；Western-blot法检测Lewis肺癌细胞CK19蛋白的表达,并使用免疫荧光检测CK19蛋白在Lewis肺癌细胞中的表达及定位。[结果]Lewis肺癌细胞CK19 mRNA阳性表达,且通过荧光染色显示CK19蛋白在其细胞膜上广泛表达,提示CK19蛋白可以作为免疫治疗的目标靶点。同时DC细胞CK19蛋白阴性表达,显然Lewis肺癌细胞中CK19蛋白表达水平明显高于DC细胞。[结论]第一部分实验采用Real-time PCR、Western-blot、免疫荧光的方法检测了Lewis肺癌细胞CK19显著表达。CK19蛋白可以作为肿瘤细胞免疫治疗的靶向抗原,同时证明Lewis肺癌细胞可以作为CK19靶向性免疫治疗的细胞,用于体内和体外细胞免疫治疗的研究。第二部分利用AdMax系统构建重组腺病毒rAd-CK19载体[研究目的]利用AdMax系统构建携带人CK19基因的重组腺病毒(rAd-CK19)载体,为下一步转染DC细胞制备肿瘤免疫疫苗做好准备。[研究方法]重组腺病毒(rAd)转移质粒载体pTR-UF5为基础构建CK19表达载体pTR-UF5/CK19。利用AdMax包装系统,首先以质粒PTR-EGFP-CK19为模板,通过PCR扩增人CK19基因cDNA片段,然后将所得的穿梭质粒pDC316-CK19和辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre利用CaCL2方法共转染入293细胞(293细胞因其容易转染的特点,是目前研究外源基因最为常用的细胞株)中,得到重组腺病毒Ad/CK19。然后使用Cs CL梯度法离心和纯化重组成功的腺病毒,以及TCID50法来测定重组腺病毒的滴度。[结果]结果显示,通过双酶切法来检测腺病毒穿梭质粒pDC316-cmv-EGFP-CK19片断大小,根据测序插入的目的基因与Gene Bank中报告的CK19cDNA进行对比,完全符合CK19基因表达。然后,通过AdMax系统,利用构建好的穿梭质粒和辅助质粒构建了重组腺病毒rAd-CK19。[结论]我们成功构建了含有肺癌相关抗原基因CK19的重组腺病毒载体Ad/CK19。经过RT-PCR检测符合预期(138bp)大小的片断,从而证实重组病毒构建成功。为下一步重组腺病毒Ad/CK19转染DCs细胞制备肺癌免疫疫苗治疗肺癌打下了基础。第三部分CK19基因修饰重组腺病毒转染树突状细胞后CK19表达分析及其表型改变[研究目的]在这一部分实验中我们将利用已构建成功的重组腺病毒rAd-CK19载体,将肿瘤靶向基因CK19通过重组病毒转入DCs细胞中,并检测转染后DCs细胞的表型变化,确定是否转染成功,从而制备为CK19基因修饰的DCs免疫疫苗。[研究方法]在该实验中,于转染的24h前将DC细胞接种于培养板,并加入不含抗生素的完全培养基。将pTR-UF5/CK19载体或pTR-UF5载体稀释于无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。在不含有抗生素和血清的培养液中加入Lipofectamine2000并稀释,然后缓慢摇匀后,于室温下进行孵育。然后使用PBS溶液清洗培养基内细胞。将清洗后的细胞复合物置入培养孔内均匀摇动以使其分布均匀。感染2小时后,收集感染细胞更换为含GM-CSF和IL-4的RMPI1640培养基,继续培养2天。转染后使用Real-time PCR、Western-blot、免疫荧光方法检测转染后DCs细胞中CK19的表达水平。另通过流式细胞仪检测DCs细胞在修饰后的表型(CD80,CD86, MHC-Ⅱ)改变。[结果]DCs细胞中CK19基因很弱的阳性表达,转染带有CK19基因腺病毒载体后CK19基因成高阳性表达,而空腺病毒载体对DCs细胞CK19基因表达没有影响。DCs细胞中CK19蛋白很弱的阳性表达,转染带有CK19基因腺病毒载体后CK19蛋白成高阳性表达,而空腺病毒载体对DCs细胞CK19蛋白表达没有影响(M0I200)。DCs细胞转染CK19以后DCs表面的CD80, CD86, MHC-Ⅱ均比转染前表达高。结果显示转染CK19有明显的促进DC细胞成熟的作用。[结论]本实验中利用同源重组原理构建CK19的重组腺病毒载体并纯化,为以CK19基因作为靶基因。然后,将携带Ad/CK19基因的合成腺病毒转染树突状细胞(DC),合成肺癌免疫疫苗rAd-CK19-DCs。为下一步体内实验利用DC细胞诱导特异性的细胞毒性T细胞(CTL)免疫反应治疗肺癌打下基础。第四部分转染CK19基因的DCs肿瘤疫苗在鼠体内抗瘤活性的研究[研究目的]根据《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》和《抗肿瘤药物药效学指导原则》的要求,评估在实验第三部分中制备的肿瘤免疫疫苗(rAd-DC-CK19)对接种Lewis肺癌细胞的小鼠的治疗作用。[研究方法]通过体外应用携带CK19基因的rAd-CK19感染DCs细胞制成的特异性疫苗(rAd-CK19-DCs),继而免疫接种Lewis小鼠肺癌,来观察瘤体生长速度(测量肿瘤体积),评估其对小鼠肺癌肿瘤生长有无抑制作用及作用强度。通过实验证实rAd-CK19-DCs疫苗可以有效抑制肺肿瘤的生长。[结果]结果显示：接种了特异性肿瘤疫苗(DC-CK19)后,实验制备的DC疫苗对肿瘤细胞的生长有着明显的抑制作用,在小鼠体内的肿瘤生长也明显延缓；rAd-CK19-DCs治疗组肿瘤体积也小于对照组(rAd-c DCs组或DCs组)的肿瘤体积。通过体内实验证实制备的rAd-CK19-DCs疫苗能诱导出小鼠CK19表位的肿瘤特异性免疫反应,并在小鼠体内产生明显的抗肺癌细胞生长的反应。[结论]实验证明我们制备的肿瘤疫苗(rAd-CK19-DCs)能够明显地抑制肺癌细胞在小鼠体内的生长。这一实验结果说明利用肿瘤特异抗原或基因为靶点,制备特异性肿瘤疫苗的方法将成为肺部恶性肿瘤精准治疗的有力武器。