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目的:(1)建立小鼠汗腺全发育模型,从组织形态、细胞水平和分子水平考察汗腺从胚胎期到成熟期的整个发育过程,由此确定在表皮干细胞分化为汗腺细胞发育过程中具有关键意义的两个时间点。(2)进一步验证上述两个关键时间点所获取细胞在生物学特征上的差异性,并确定胚胎期(E12.5)小鼠足部表皮干细胞与其他部位表皮干细胞的一致性。(3)在上述研究的基础上,筛选并鉴定小鼠表皮干细胞向汗腺细胞特化和定向分化过程中所涉及的关键转录因子。(4)深入探讨上述关键转录因子在表皮干细胞向汗腺细胞特化及定向分化过程中的细胞分子机制,从而为探索新的汗腺修复及再生途径提供策略。方法:(1)选取同一种属但不同时期(E12.5、E17.5、P0.5、P5和P28)小鼠足部皮肤,通过分离培养不同时期小鼠汗腺原代细胞,观察其形态学变化;采用免疫荧光和RT-PCR法检测其角蛋白表达特征。(2)选取E12.5和P5小鼠足部皮肤,通过分离培养不同时期小鼠原代表皮干细胞和汗腺细胞,观察其形态学差异;凭借组织切片HE染色法,观察不同时间点皮肤组织的结构;利用免疫荧光的方法检测其角蛋白表达差异。选取E12.5d小鼠足部皮肤和背部皮肤,采用组织切片HE染色法,观察相同时间点(E12.5)小鼠足部皮肤和背部皮肤组织的结构,利用免疫荧光的方法检测其角蛋白表达特征。(3)选取同一来源的E12.5和P5小鼠足部汗腺细胞,通过Trizon法提取Total RNA和Hi Seq2500进行转录组测序寻找差异表达基因,通过生物信息学分析选定关键转录因子,并利用RT-PCR和Western blot法分别做分子生物学验证。(4)构建关键转录因子(Fox-c1和Irf-6)相关慢病毒载体在Polybrene辅助下进行小鼠表皮干细胞的感染,分为四组,control组、只转染Fox-c1组、只转染Irf-6组和共同转染Fox-c1和Irf-6(F+I)组。选取转染后0d和14d两个时间点,观察转染后细胞形态学变化;根据汗腺细胞与表皮干细胞贴壁能力的显著差异检测转染后细胞转化效率;利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力;通过细胞免疫荧光和Q-PCR法分别检测转染后不同组细胞角质蛋白在蛋白质和m RNA水平的表达。构建小鼠足趾部深II度烧伤模型,将转染5d后的细胞注入烧伤部位,11d后进行检测。通过组织切片HE染色法观察汗腺细胞在体内再生的形态学情况;利用免疫荧光法检测不同转染组注入小鼠足部烧伤部位后汗腺细胞角质蛋白的表达;最后利用碘-淀粉试验检测汗腺功能。结果:(1)P0.5到P28汗腺卷曲成团并出现导管部和分泌部。细胞免疫荧光检测结果显示,汗腺细胞在整个发育过程中K8和K19呈阳性表达,且在出生后各时间点表达增强;E12.5和E17.5时K14表达较强,其余时间点均较弱;出生前K10表达呈阴性,但出生后有逐渐增强的趋势。RT-PCR结果显示与细胞免疫荧光结果基本相符,组织切片免疫荧光结果显示,汗腺分泌部多见K8和K19高表达细胞;汗腺导管部则多见K10高表达细胞;K14高表达细胞则出现在出生前或出生后包绕汗腺的肌上皮处。(2)细胞形态学结果显示E12.5小鼠足部表皮干细胞为长梭形,而P5小鼠足部汗腺细胞卷曲成团,有汗腺导管部出现;HE染色结果显示在E12.5小鼠足部皮肤组织无汗腺结构,而P5小鼠足部皮肤组织可见明显汗腺结构;细胞免疫荧光结果显示,表皮干细胞K5和K14的表达相对较高,而汗腺细胞K8和K18的表达相对较强。HE染色结果显示在E12.5小鼠足部皮肤和背部皮肤组织结构相同,且免疫荧光结构显示两者的角质蛋白(K5/K14)表达一致。(3)生物信息学分析筛选出小鼠表皮干细胞向汗腺细胞特化和定向分化的关键转录因子为Fox-c1和Irf-6,RT-PCR和Western blot结果均显示汗腺细胞Fox-c1和Irf-6的表达均明显高于表皮干细胞的表达。(4)CCK-8检测结果显示转染后的细胞增殖能力发生明显变化;细胞形态学结果显示转染后14d的表皮干细胞呈现出类汗腺细胞的形态;细胞免疫荧光和Q-PCR结果显示,相比较于control组,转染组细胞K5/K14和K8/K18的表达均明显增高。将转染后细胞分别注射到烫伤的小鼠足部表皮,14d组织切片HE结果显示,control组和Irf-6组未见汗腺样结构,Fox-c1组和F+I组可见汗腺样结构;组织切片免疫荧光结果显示与体外细胞免疫荧光结果显示相同;碘-淀粉试验显示control组和Irf-6组阴性,而Fox-c1组和F+I组碘-淀粉试验阳性。结论:(1)建立了小鼠汗腺全发育模型,从组织形态、细胞水平和分子水平考察汗腺从胚胎期到成熟期的整个发育过程,并由此确定了在表皮干细胞分化为汗腺细胞发育过程中具有关键意义的两个时间点,即E12.5和P5。(2)进一步验证上述两个关键时间点(E12.5和P5)所获取细胞在生物学特征上的差异性,并确定胚胎期(E12.5)小鼠足部表皮干细胞与其他部位表皮干细胞的一致性。(3)在上述研究的基础上,筛选并鉴定小鼠表皮干细胞向汗腺细胞特化和定向分化过程中所涉及的关键转录因子为Fox-c1和Irf-6。(4)深入探讨上述关键转录因子(Fox-c1和Irf-6)在表皮干细胞向汗腺细胞特化及定向分化过程中的细胞分子机制,从而为探索新的汗腺修复及再生途径提供策略。