论文部分内容阅读
肿瘤细胞对抗癌药物产生抗药性，尤其是多药抗药性(multidrugresistance，MDR)，是肿瘤化疗失败的主要原因，也是肿瘤化疗领域急需解决的难题。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时，对结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉抗药性。MDR的形成机制十分复杂，包括肿瘤细胞泵出药物增多和减少药物进入，细胞周期检测点的紊乱，细胞凋亡途径变化，药物靶点的改变以及DNA损伤修复系统障碍，等等。肿瘤细胞可通过不同途径导致MDR的产生，同时单个MDR细胞可同时存在多种耐药性的机制，一种或多种机制联合作用均可导致MDR产生。目前研究的比较多的、也是最为常见的机制是肿瘤细胞过表达一类含有ATP结合框架的膜通道蛋白(ATP-binding cassettetransporters，ABC transporters)。这类通道蛋白是一个大家族，目前发现它共有48个成员，分为7大类，从ABCA至ABCG。在这个家族中，与肿瘤MDR关系最为密切的是P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp/MDR1/ABCB2)、多药耐药性相关蛋白(multidrug resistance associated-proteins，MRPs/ABCCs)和乳腺癌耐药蛋白(breastcancer resistance protein，BCRP/ABCG2/MXR)。三者均是是跨细胞膜的糖蛋白，其胞质亲水区为ATP结合位点，跨膜疏水区具有通道蛋白特性，构成其ATP依赖的膜泵结构特点。一般认为当肿瘤细胞胞膜上过度表达这些膜蛋白时，这些膜蛋白将结合抗癌药物，同时其ATP结合位点结合上ATP，然后ATP水解后释放的能量使药物被泵到胞外，使细胞内的药物浓度始终维持在较低水平，肿瘤细胞从而获得耐药性。
理论上克服MDR有两种方法：一、开发对MDR肿瘤细胞不具有抗药性的新抗癌药物；二、寻找MDR逆转剂与抗癌药物合用，恢复MDR肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。尽管现阶段现有的众多MDR逆转剂在体外及动物模型中都具有很好的逆转效果，但是在临床实验中，这些逆转剂由于可引起严重的毒副作用、干扰传统抗癌药物的药代动力学等种种原因，都没有取得预期的临床效果，因此急需开发新的逆转剂来逆转MDR。近年来，随着科学技术的迅猛发展，新的生物技术如RNA干扰(RNA interfering，RNAi)的出现，新的天然药物的分离以及新的化合物的合成，为成功开发MDR逆转剂带来了希望。本课题先后采用多种策略来逆转P-gp和BCRP介导的肿瘤MDR，并取得了较好的结果。
1.通过筛选发现，经PCR合成的MDR1-Ⅴ siRNA表达框架的干扰效果在五个MDR1-(Ⅰ-Ⅴ)siRNA表达框架中是最好的，然后构建含有该表达框架的质粒pEGFPC<,2>-H1-MDR1shDNA，并将其转染入过表达P-gP的MDR肿瘤细胞KB<,v200>，通过G418筛选得到稳定表达MDR1 shRNA的细胞克隆KB<,v200>/MDR1sh。KB<,v200>/MDR1sh细胞的MDR1基因的mRNA和P-gp表达降低超过90﹪，并且持续稳定表达增强型绿色荧光蛋白和低水平的MDR1基因超过10代。与KB<,v200>细胞相比，KB<,v200>/MDR1sh细胞相对敏感株KB细胞对长春新碱的抗药性从62.4倍降到10.5倍，对阿霉素的抗药性从74.5倍降到9.5倍，并且胞内的阿霉素积累从0.30±0.08nmoles/10<6>ceils增加到0.86±0.16nmoles/10<6>cells，胞内的罗丹明123的荧光强度从3.58±1.63/10<6>cells胞增加到13.96±3.07/10<6>cells。在裸鼠移植瘤模型中，长春新碱(0.2mg/kg)对KB<,v200>/MDR1sh细胞移植瘤的抑瘤率达到42.0﹪，而对KB<,v200>细胞移植瘤没有抑制作用。这些结果说明在体内和体外的模型中采用RNA干扰技术沉默MDR1基因表达可以有效的逆转MDR。在探讨MDR形成机理及相应的逆转机制的过程中，发现与敏感株细胞KB和MCF-7相比，MDR肿瘤细胞KB<,v200>和MCF-7/Adr不仅过表达P-gp，而且凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族成员Survivin和XIAP也高表达，同时对阿霉素、多西紫杉醇和长春新碱有很高的抗药性。而肿瘤细胞过表达P-gp和IAPs是形成MDR的两个常见的机制。然而在MDR肿瘤细胞内P-gp和IAPs之间的相互关系目前还不清楚。为此，本课题对此进行了研究。通过转染质粒pECFPN1-Survivin和pcDNA3-6myc-XIAP到上述4个细胞株内使其高表达Survivin和XIAP，但不影响它们的P-gp的表达情况。同时通过转染Survivin和XIAP的siRNA到KB<,v200>和MCF-7/Adr细胞内沉默其Survivin和XIAP的表达，一样不影响它们的P-gp的表达情况。另外，免疫共沉淀结果显示Survivin和XIAP与P-gp之间没有直接的相互结合作用。因此，这些结果表明在MDR肿瘤细胞内高表达的Survivin和XIAP与P-gp之间没有直接相互作用关系，但是否还有间接的作用关系还需进一步研究。
2.通过对海洋海绵化合物的筛选，发现分离于红海海绵Siphonochalinasiphonella的sipholane triterpenoids类化合物sipholenol A能够有效地特异性地逆转P-gp介导的肿瘤MDR。在过表达P-gp的MDR肿瘤细胞KB-C2和KB-V1内，sipholenol A浓度依赖性地增加秋水仙碱、长春碱已及紫杉醇这些P-gp底物抗癌药物的细胞毒性，而对非P-gp底物抗癌药物顺铂的细胞毒性无影响。并且在无P-gp表达或表达MRP1或表达BCRP的细胞内，sipholenol A并不影响细胞毒药物对它们的敏感性。放射性标记的紫杉醇的积累和泵出实验结果显示sipholenol A浓度依赖性地增加KB-C2和KB-V1细胞内紫杉醇的积累，通过直接抑制P-gp的药物泵功能。sipholenol A不影响KB-C2和KB-V1细胞内P-gp的表达，但是却能够剂量依赖性的激活P-gp的ATP酶活性，并且抑制[<125>Ⅰ]-Iodoarylazidoprazosin(IAAP)对P-gp的光结合性标记。因此，这些结果显示sipholenol A通过与P-gp直接结合而抑制其药物泵功能，从而逆转MDR，这类化合物可能是新的高效的MDR逆转剂。
3.有报道显示表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂gefitinib能逆转P-gp和BCRP介导的MDR。然而，是否其他的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂也有与gefitinib类似的这个作用还不清楚。本研究对其他两个表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂AG1478和erlotinib进行了研究，结果发现，AG1478在P-gp高表达的细胞内能够轻微地增加P-gp底物抗癌药物的敏感性和细胞内紫杉醇的积累，而在BCRP高表达的细胞内却明显增加BCRP底物抗癌药物的敏感性和细胞内米托葸醌的积累；然而erlotinib无论在P-gp还是BCRP高表达的细胞内均能显著地增加P-gp或BCRP底物抗癌药物的敏感性和细胞内紫杉醇或米托葸醌的积累。两者对非P-gp或非BCRP底物无影响，对MRP1高表达的细胞株以及敏感株也均无影响。同时，两者均能显著地抑制BCRP介导的E<,2>17β G和甲氨蝶呤的药物输送。此外，ATP酶结果显示AG1478对P-gP的ATP酶几乎没有影响却能明显激活BCRP的ATP酶，而erlotinib能明显激活P-gP和BCRP的ATP酶活性。有趣的是，AG1478和erlotinib对[<125>Ⅰ]-IAAP在P-gP和BCRP上的光结合性标记均无影响。因此，本研究对表皮生000长因子受体酪氨酸激酶抑制剂在临床上的联合应用及开发新的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂均有一定的意义。