激发子是来源于病原菌(真菌、细菌、卵菌及病毒等)、非病原菌、寄主植物和非寄主植物的能够诱导植物产生防卫反应的信号分子,包括蛋白质、糖蛋白、寡糖、多肽以及脂类等,其中最主要的是蛋白类激发子,尤其是真菌蛋白激发子。真菌蛋白激发子是广泛存在于植物病原真菌中,具有广谱诱导植物抗病性、促进植物生长的信号传导分子。真菌蛋白激发子是非特异性的激发子,能够诱导植物自身抗病基因的表达,启动植物防卫反应和免疫系统,提高植物自身免疫力,通过调节植物生长代谢系统,促进植物生长、促进植物种子萌发,引起植物的过敏反应等。因此真菌蛋白激发子有开发为新型的生物农药的潜力。根腐病不仅是农作物的严重病害,同时又是中药材栽培中的顽固性病害,目前尚未找到有效的根治措施。引起中药材根腐病的病原菌主要是镰孢菌包括尖孢镰菌、茄病镰刀菌、燕麦镰刀菌、木贼镰刀菌、半裸镰刀菌、立枯丝核菌等。不同种类的药用植物被镰孢菌属病菌侵染后其根、块根、块茎、休眠芽等地下部分均腐烂坏死,呈黄色、褐色干腐状,对药用植物本身及其药用价值造成很大的损失。大豆根腐病(Soybeanrootrot)是大豆产区普遍发生的根部病害,一般在土壤潮湿地块或多雨年份发病严重,病情指数较高;是由大豆根腐病菌侵染引起的。在病株根及茎基部会产生椭圆形褐色长条形甚至不规则形的凹陷斑直至扩展成环绕状,但不会导致主根的大斑块,不会引起病株枯死,但会导致大量减产。尖镰孢菌属半知菌亚门镰孢属,能引起大豆、禾谷类以及药用植物的根腐病。禾谷类尖镰孢菌基本已研究透彻,但是源于豆科尤其是来源于大豆的尖镰孢菌蛋白激发子的研究并不多。目前尚未见从大豆根腐病原菌尖镰孢菌中分离纯化出具有生物活性的蛋白激发子的相关报道。本文通过超声破碎、离心、不同温度处理、凝胶过滤、离子交换和分子筛等联用的方法,从大豆根腐病菌尖镰孢菌中首次分离出一表观分子量约为40kD的蛋白,以小麦、大豆为生物材料,考察其对小麦种子萌发和幼苗生长、小麦幼苗根系生长和根系活力、小麦抗旱性以及大豆防御相关酶活性的生物学活性的影响。研究结果如下:1 建立了尖镰孢菌40kD蛋白激发子初步纯化体系尖镰孢菌在PD培养基中培养后高速离心得菌丝体,用Tris-HCl缓冲液提取总蛋白,分别室温、煮沸处理30min,离心取上清,再经Hitrap Q HP离子交换柱层析,通过洗脱峰对小麦种子的发芽率以及幼苗的生长作为生理指标,确定蛋白粗提液以及粗纯化峰具有一定蛋白质激发子活性。2 40kD尖镰孢菌蛋白激发子的粗提液的纯化及其活性研究蛋白粗提液经过不同温度(室温、40℃、60℃、80℃、100℃)处理后,经脱盐处理后再经Source 30Q Column后纯化出含目的成分的峰,进行活性检测,发现在小麦幼苗生长至第6d时,室温、40℃、60℃与对照相比,差异显著即明显促进幼苗的生长,尤其是60℃处理的。因此进一步将 60℃Source 30Q Column 活性峰经 Superdex 200 3/200 GL column纯化,得到分子量约为40kD单条带,经检测其具有活性。说明该蛋白是一种来源于大豆根腐病菌—尖镰孢菌的新型蛋白激发子,是首次从此菌中分离纯化出的蛋白激发子。3 40kD尖镰孢菌蛋白激发子的生物活性研究对于40kD尖镰孢菌蛋白激发子的生物学活性研究包括小麦幼苗根系生长和根系活力、小麦抗旱性以及大豆防御相关酶活性的生物学活性的影响。用浓度为1、5、10ug/ml的40kD蛋白液处理5d后,小麦幼苗株高分别比对照提高5.64%、11.25%和14.69%;浓度为1、5、10、20ug/ml的40KD蛋白液处理6d后,小麦根系琥珀酸脱氢酶活力比对照分别提高1.78%、3.52%、7.79%和14.37%;5ug/ml蛋白液处理小麦后,小麦抗旱综合系数比对照提高了 59%,说明该纯化蛋白能够增强小麦的抗旱性,而且可能与其根系活力的增加有关。PAL、CAT和PPO均与植物的抗病性有关。测定纯化蛋白液处理后的大豆叶肉内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)活性的变化。经蛋白液处理后,大豆叶肉内的PAL、CAT和PPO的活性均有不同程度的提高。蛋白液诱导后24h,PAL活性达到最高值,比对照组增加了 62.5%;在蛋白液诱导48h,CAT和PPO活性均达到最高值,并且比对照组分别增加了 98.7%和150%。实验结果表明:尖镰孢菌的蛋白液能够促进小麦幼苗根系的生长,增强小麦的抗旱性和大豆防御相关酶活性,该纯化蛋白是具有生物学活性的蛋白激发子。4 40kD尖镰孢菌蛋白激发子质谱序列分析纯化所得活性蛋白进行SDS-PAGE电泳后,将电泳条带切下进行质谱鉴定,得到该蛋白的肽指纹图谱,将得到肽指纹图谱于数据库(NCBI)中搜索,均无匹配蛋白结果,说明该蛋白为一全新蛋白。根据一级质谱做二级质谱分析,得到了不同的肽段;经过NCBI搜库跨种匹配得到两个得分较高的蛋白gi|691788124和gi|302696543,这两种蛋白均来源于大型真菌,均是假定蛋白,具有水解酶或者肽酶活性,特异性的水解天冬氨酸。本文首次从尖镰孢菌中分离纯化出了一种蛋白激发子,经SDS-PAGE检测其蛋白相对分子量约为40kD。质谱测定结果表明,尖镰孢菌蛋白激发子为一全新的蛋白。该蛋白能够促进小麦幼苗及其根系的生长,诱导促进小麦根系活力的增长,诱导小麦的抗旱性以及诱导促进大豆防御相关酶的活性的增加,为发掘具有生物学活性新型真菌源蛋白类激发子提供思路;对于防治由镰孢菌引起的药用植物和大田作物病害具有潜在的应用开发价值。