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氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,简称EC)是一种潜在致癌物,在许多发酵酒中均存在,其主要来源于发酵过程中酵母代谢产生的尿素。为了控制葡萄酒中EC的含量,本研究从阻断尿素的来源(敲除分解精氨酸为尿素和鸟氨酸的精氨酸酶基因CAR1),促进尿素的分解(过表达分解尿素为NH3和CO2的尿基酰胺酶基因DUR1,2)和加快酵母细胞对发酵液中尿素的吸收(过表达尿素转运蛋白Dur3p基因DUR3)三方面着手,主要研究内容如下:(1)以二倍体酿酒酵母WY-1为出发菌株,分别构建了一个CAR1等位基因单敲除和两个CA4R1等位基因双敲除突变株YZ11和YZ22。CAR1基因转录水平的分析及葡萄酒发酵试验表明,突变菌株YZ11与出发菌株相比,CAR1基因表达量降低了63%,尿素含量降低了 14.56%,EC含量降低了 23.71%,并且常规指标无明显变化;突变菌株YZ22与出发菌株相比,CAR1基因表达量几乎为0,尿素含量降低了 77.89%,EC含量降低了 73.78%,基因改造使菌株发酵速度变慢,且发酵葡萄酒中精氨酸含量升高,脯氨酸含量降低,其他常规指标无明显变化。(2)以二倍体酿酒酵母WY-1为出发菌株,分别构建了过表达转化子WY-DUR1,2和WY-DUR3。葡萄酒发酵试验表明,菌株WY-DUR1,2与出发菌株相比,尿素的含量降低了 51.88%,EC含量降低了 45.81%,并且常规指标无明显变化;菌株WY-DUR3与出发菌株相比,尿素含量降低了 54.54%,EC含量降低了 48.16%,并且常规指标无明显变化。(3)构建了敲除CAR1基因同时过表达DUR1,2基因的突变株CD1,2。对DUR1,2基因转录水平的分析及葡萄酒发酵试验表明,菌株CD1,2与出发菌株相比,CAR1基因表达量降低了 63%,DUR1,2基因的表达量提高了 3.64倍,尿素的含量降低了40.35%,EC的含量降低了 34.44%,并且常规指标无明显变化。(4)构建了敲除CAR1基因同时过表达DUR3基因的突变株CD3。对DUR3基因转录水平的分析及葡萄酒发酵试验表明,菌株CD3与出发菌株相比,CAR1基因表达量降低了 63%,DUR3基因的表达量提高了 3.21倍,尿素的含量降低了 45.68%,EC的含量降低了 36.89%,并且常规指标无明显变化。