背景原发性肝细胞癌(以下简称肝癌或HCC)是我国第二位癌症杀手,尽管经过百余年的努力,肝癌临床已有长足进步,但总体而言,其预后仍然险恶。肝癌预后不佳的一个重要原因是不少病人在初次诊断时肿瘤就已经侵犯门静脉并形成门静脉癌栓(以下简称PVTT)。门静脉癌栓一旦形成,不仅阻断了肠道血液的回流,加重门静脉高压,导致消化道出血、腹水形成,影响肝脏营养的获得,还导致肝内肿瘤的播散,等等。这是肝癌临床的一大难题,而其实质则是肝癌侵袭转移特性的表现。已有证据表明,肝癌侵袭转移潜能并非癌症晚期所独有,不少小的肝癌也可出现血管癌栓,导致手术切除后早期复发转移。因此,研究肝癌门静脉癌栓,是肝癌临床与基础研究的一个重要问题。不解决癌栓问题,就难以改善肝癌病人的预后。因而深入研究肝癌门静脉癌栓的发病机制、生物学特性,实现对肝癌及门静脉癌栓的有效防治具有重要的意义。但是,对肝癌及门静脉癌栓进行实验研究不能直接在人体进行,需要建立便于体内研究肝癌的肝癌动物模型和体外研究肝癌的肝癌细胞系,因此细胞系在肿瘤理论和应用研究上具有十分重要的价值。由于肿瘤的异质性和复杂性,不同组织来源的细胞,其一些特性和针对性可能不尽相同,所以建立来源于门静脉癌栓的肝癌细胞系对于深入研究门静脉癌栓具有重要意义。目的建立来源于门静脉癌栓的肝癌细胞系,并对其生物学特性进行分析,为研究门静脉癌栓形成机制提供实验材料。方法第一部分:来源于门静脉癌栓的人肝癌细胞系CSQT-1的建立胶原酶消化法对活体人肝癌标本及门静脉癌栓标本进行原代培养;采用挑取克隆细胞岛扩大培养、自然纯化法行单一肝癌细胞纯化;光学显微镜观察细胞生长情况;胰蛋白酶法消化传代培养细胞;采用慢冻和快融进行细胞的冻存和复苏。第二部分:人肝癌细胞系CSQT-1的生物学特性鉴定细胞形态学观察采用光镜观察;超微结构用电镜观察;胎盘蓝染色计数检测冻存后复苏存活率;细胞计数法测定贴壁率;MTT法测细胞生长期曲线;流式细胞仪分析细胞周期和DNA组成;常规制备染色体标本,拍照分析核型;克隆形成实验检测细胞克隆形成率;裸鼠皮下接种CSQT-1细胞悬液,接种后观察成瘤情况,计算异种移植率;透射电子显微镜鉴定细胞系的污染情况。第三部分:构建人肝癌门静脉癌栓裸鼠模型及细胞系CSQT-2的建立和特点分析将人肝癌门静脉癌栓新鲜组织接种到裸鼠肝脏包膜下,形成移植瘤,然后利用移植瘤过继传代到裸鼠肝脏,经过5次传代后,移植瘤生长比较稳定。取裸鼠移植瘤,采用胶原酶消化法以及挑取克隆细胞岛扩大培养、自然纯化法行单一肝癌细胞纯化新建细胞系。对该新建细胞系进行生物学特性分析,将裸鼠成瘤的肝脏用石蜡包埋后制成标本,并使用HE染色后观察有无裸鼠门静脉镜下微癌栓的出现。结果第一部分:细胞原代培养早期,生长比较不稳定,10代以前细胞传代培养时需要较高的接种密度,而且细胞倍增时间不同。到第15代时细胞生长已比较稳定。细胞呈上皮样,大小不一,以多角形、多边形为主,占90%以上。细胞在高密度时(>2×106/mL)可见重叠及堆积生长。传代时间一般为2-3天。第二部分:CSQT-1细胞生物学特性鉴定利用人肝癌门静脉癌栓新鲜组织块进行原代培养起来的细胞系CSQT-1,扫描电镜显示细胞表面丰富微绒毛,细胞大小不等,直径在10-20um之间,透射电镜下见细胞以不规则型为主,细胞间有桥粒紧密连接等,有少量连接复合;细胞间有形成腺结构及条索结构倾向,可形成类似胆小管结构;细胞质丰富,有大量糖原颗粒形成糖原湖样结构;线粒体、粗面内质网较发达,有丰富的游离核糖体;细胞长满瓶底后,有重叠现象细胞失去接触抑制生长核质比例倒置等。冻存后复苏成活率为95%。细胞生长曲线显示上皮样恶性肿瘤生长特性,细胞群体倍增时间为48h,4h后贴壁率已超过90%,细胞软琼脂中生长,克隆形成率为20%。DNA周期分析:G0/G1为64%,G2/M为19%,S为10%。染色体众数以亚四倍体为主。细胞培养上清液AFP阴性,HBsAg阴性。CSQT-1细胞能在裸鼠中的成瘤。透射电镜检CSQT-1细胞无支原体污染。第三部分:通过裸鼠皮下移植瘤及外科原位接种的方法建立了人肝癌门静脉癌栓裸鼠皮下移植瘤模型和人肝癌门静脉癌栓原位移植模型,并且在该肝脏肿瘤组织中成功培养出CSQT-2细胞系。通过对该细胞系进行核型分析及光电镜分析显示其起源于人肝癌门静脉癌栓组织,并且从其成瘤的肝脏中找到了镜下门静脉微癌栓的证据。结论1.由人肝癌门静脉癌栓组织培养的CSQT-1细胞系和通过裸鼠原位移植瘤培养的CSQT-2细胞系均能稳定生长,具有无限生长的能力。该细胞系保持了来源组织的一些特性,AFP和HBsAg阴性,细胞间有形成腺结构及条索结构倾向。2.来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系和其他人肝癌细胞系相比,有其不同的生物学特性,主要表现为:①直接来源于人肝癌门静脉癌栓组织或者裸鼠原位移植瘤;②生长较迅速,贴壁快,细胞倍增时间分别为48h和36h;③AFP阴性,而大多数人癌细胞系的AFP为阳性。④一定数量的细胞种植于裸鼠后能形成肿瘤,且肿瘤随着时间生长迅速;⑤生物学特性稳定,对不同代细胞的生长特性、肿瘤标记物和与肝癌干细胞标记物CD133阳性率检测结果,未显示有明显变化。⑥来源于人门静脉癌栓的细胞系也具有在裸鼠形成门静脉癌栓的能力。因此,CSQT-1及CSQT-2是两株新建的来源于肝癌门静脉癌栓的人肝癌细胞系,是体外研究肝癌门静脉癌栓形成及防治的一个良好模型。本课题创新点及潜在应用价值建立了来源于门静脉癌栓的肝癌细胞系并对其生物学特性进行了分析,在文献上尚未见相关的报道,该细胞系为体外研究肝癌门静脉癌栓形成机制提供了实验材料。