原生质体融合技术是一种微生物育种方法,该方法简便、易行。利用该方法选育目的菌株的过程中仍然存在许多需要解决的问题。本试验以康氏木霉和酿酒酵母为出发菌株,对原生质体融合技术进行了研究,确定了纤维素酶高产菌株康氏木霉原生质体制备及再生的适宜条件,为该菌细胞融合和诱变育种提供适宜的真菌状态。同时对融合株的一些遗传性状进行了相关研究。该研究为微生物育种工作奠定了基础。本试验对影响康氏木霉原生质体形成和再生的各种因素(菌龄,蜗牛酶浓度,酶解温度和时间,渗透压稳定剂的成份和浓度)进行试验比较。结果表明,康氏木霉原生质体制备的最佳条件:菌龄为22 h,蜗牛酶浓度为2.0%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5 h,蜗牛酶溶液中的渗透压稳定剂为0.6 mol/L NaCl,在制备康氏木霉原生质体时观察到原生质体的释放方式主要有两种:顶端释放和段端位释放。本试验原生质体制备方法可以获得细胞融合和细胞突变诱导所需要的原生质体数量。本试验对康氏木霉原生质体的再生培养基进行了研究,确定了康氏木霉原生质体的最佳再生培养基为0.8 mol/L蔗糖YPD再生培养基,康氏木霉原生质体在0.8 mol/L蔗糖YPD再生培养基上平均再生菌落数为4.13×105个/mL。同时观察到了康氏木霉原生质体的一种再生方式。本试验采用抗药性遗传标记和热灭活两种方法作为融合菌株的筛选标记,确定了制霉菌素的标记浓度为750 U/mL,无水乙醇的标记浓度为23%。康氏木霉的热灭活温度为67℃,时间为10 min。本试验采用康氏木霉原生质体单亲热灭活(酿酒酵母采用抗药性遗传标记)和双亲均采用抗药性遗传标记两种方法共筛出246株融合菌株。本试验初筛采用TTC作为显色剂筛选出发酵葡萄糖能够产酒精的融合株,然后将此融合菌株在羧甲基纤维素钠培养基上进行复筛,筛选出分解葡萄糖产水解圈较大的融合株,TTC和羧甲基纤维素钠培养基能够筛选出既产酒精又产纤维素酶的融合株。将筛选出的融合株进行遗传稳定性试验最终得到4株稳定融合菌株。本试验最后对遗传性稳定的4株融合菌株进行了个体形态、生化特性、特定基因序列和可溶性蛋白等方面的遗传性质研究,研究发现:融合菌株B1、B2、B3确实进行了基因重组,但其酶活和产酒精能力都比亲本低。但是这些研究为原生质体融合育种工作提供了有益的参考。