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目的:寻找精神疾病易感基因NPAS3调控VGF的具体分子机制,并探究二者在神经细胞增殖过程中的作用,及此过程的潜在分子机制。方法:采用lipofectamine3000转染真核表达载体、短发夹RNA或小干扰RNA,达到过表达或敲低NPAS3与VGF的目的。免疫荧光技术检测大鼠海马中NPAS3与VGF的表达位置。利用大鼠神经干细胞作为体外模型,qPCR及Western blot分别检测mRNA和蛋白水平NPAS3对VGF的调控。构建缺失κB结合位点的VGF启动子,荧光素酶报告基因检测不同NPAS3水平下,全长(1237bp)及截短(990bp)VGF启动子的的活性。使用NF-κB抑制剂Caffeic Acid Phenethyl Ester(CAPE)刺激细胞或/和改变NPAS3表达含量,Western blot检测不同处理下VGF、NF-κB p65、NF-κB p52的蛋白水平变化。给及细胞不同处理,CCK8检测各组细胞增殖程度。Western blot检测过表达NPAS3和/或使用代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)抑制剂2-methyl-6-(phenylethynyl)-pyridine(MPEP)、敲低VGF和/或过表达NPAS3后,下游分子蛋白激酶D(PKD)的磷酸化水平。通过过表达NPAS3和/或使用N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)(离子型谷氨酸受体之一)抑制剂Dizocilpine(MK-801)、敲低VGF和/或过表达NPAS3 Western blot方法检测钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)的活化程度。结果:转染过表达NPAS3质粒pcDNA3.1-NPAS3 48小时后,293T细胞中NPAS3蛋白含量明显升高;转染四种小干扰RNA质粒敲低NPAS3,Western blot结果表明敲低效果明显,其中NPAS3-sh-892质粒效果最好,用于后续实验。免疫荧光结果显示NPAS3与VGF定位重合,主要分布于海马体齿状回颗粒细胞下层及颗粒细胞层。在大鼠神经干细胞中,qPCR结果表明过表达NPAS3可以上调VGF的转录(p<0.01);相反,敲低npas3蛋白vgf的转录水平显著减弱(p<0.01),此结果与前期基因芯片结果一致。在蛋白水平上,过表达npas3蛋白后vgf蛋白明显升高(p<0.001),而下调npas3水平后,vgf也随之下降(p<0.01)。荧光素酶报告基因检测npas3不同水平下,vgf启动子活性强弱,结果显示:无论vgf启动子上是否含有κb结合位点,高表达npas3都能激活vgf启动子,但是含有κb结合位点的vgf启动子(1237bp)的活性显著强于缺失κb结合位点的vgf启动子(990bp)(p<0.01);相反,敲低npas3后,与对照组相比,vgf启动子的活性虽然减弱,但含有κb结合位点的vgf启动子(1237bp)活性依然强于缺失κb结合位点的vgf启动子(990bp)(p<0.05),说明npas3可以通过vgf启动子上的κb位点增强其活性。通过使用cape,进一步检测vgf及nf-κb家族成员p65、p52蛋白水平变化,westernblot结果显示当使用cape后vgf表达降低(p<0.001);与dmso组相比,过表达npas3促进vgf表达的作用可以被cape拮抗(p<0.01);对于nf-κbp65蛋白,上调npas3的含量可以促进其表达的水平,而且使用cape后,其变化水平与vgf变化基本一致;而p52的蛋白含量在各种处理下则没有相应的变化趋势,说明npas3可以通过p65间接影响vgf的表达。cck8结果表明,在神经细胞系中,npas3可以促进细胞增殖(p<0.05);敲低vgf后,与对照组比较发现细胞增殖程度呈现减弱的趋势,过表达npas3同时敲低vgf较敲低vgf组细胞增殖明显增强(p<0.05)。分析npas3促进细胞增殖的分子机制,在mglur5通路中,pkd的含量可以被npas3调节(p<0.001);使用mpep后,与dmso组相比,磷酸化pkd水平降低(p<0.05),而过表达npas3同时给予mpep刺激后,pkd磷酸化水平不再升高,说明npas3通过mglur5调控pkd;敲低vgf后,磷酸化pkd含量降低(p<0.001),而与对照组相比,过表达npas3同时敲低vgf后,磷酸化pkd仍然显著下降(p<0.001),说明npas3通过vgf激活mglur5调控下游分子pkd。同时,检测nmda受体通路,与mglur5结果一致,过表达npas3含量能促进camkii的磷酸化(p<0.001),而此效应可被nmda受体抑制剂dizocilpinemk-801所拮抗;同样,敲低vgf可减少磷酸化camkii的含量,而过表达npas3也不能扭转此现象(p<0.001)。结论:1、精神疾病易感基因npas3与神经营养诱导因子vgf共定位于大鼠海马齿状回颗粒细胞下层及颗粒细胞层。2、在大鼠神经干细胞中,NPAS3可以调控VGF的转录与表达。3、NPAS3可以通过NF-κB(p65)通路调控VGF。4、NPAS3能通过VGF促进神经细胞增殖。5、NPAS3和VGF通过代谢型谷氨酸受体5和N-甲基-D-天冬氨酸受体通路激活下游分子蛋白激酶D(PKD)和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)参与细胞增殖。