[研究背景与目的]Farnesoid X Receptor (FXR)是激素核受体超家族成员之一。它主要表达在肝脏和小肠内。FXR被其配体激活后,在转录水平调节胆酸,胆固醇,甘油三酯和糖类的代谢。作为胆酸的细胞内感受器,FXR的主要功能是通过调控参与胆酸合成,运输,结合反应和解毒等代谢过程的各种基因的表达来维持胆酸代谢的平衡。肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其预后非常差。最近越来越多的研究关注原发性肝癌和代谢性疾病如糖尿病,肥胖症,非酒精性脂肪肝的关系。代谢性疾病和原发性肝癌的相关性提示肝脏的代谢失调可能是肝癌发生过程中的一个非常重要的步骤。在第一部分的研究中我们发现一种能自发性地发生肝癌的小鼠模型,这种小鼠缺失FXR基因。我们用这个动物模型来探讨在代谢失调的背景下,肝癌发生的分子机制。肝脏再生过程由许多有机结合的阶段构成,在这个过程中,许多信号通路被激活。人类移植肝脏再生过程的调控与实验动物肝脏部分切除术后再生过程的调控颇为相似。最近的一个研究结果显示小鼠肝脏的正常再生必需有胆酸信号的存在。Cyp7A1基因编码经典胆酸合成途径中的限速酶胆固醇7α-羟化酶。许多因素参与调节Cyp7a1基因的转录,如胆酸,核受体,蛋白激酶C激活剂,细胞因子,生长因子。其中胆酸扮演着最重要的角色。在第二部分的研究中我们采用70%肝脏切除的小鼠模型来探讨正常肝脏再生过程中胆酸介导的负反馈抑制Cyp7a1基因表达的分子机制。对肝脏再生过程的机制的认识有助于人类发现许多严重肝脏疾病的新的治疗方法。[实验方法]第一部分1.野生型小鼠四周大的时候,腹腔内注射单剂量的肝脏致癌物DEN或注射PBS作为对照。之后它们喂以标准的食物或喂以含0.2%CA的食物30周。雌性FXR-/-小鼠11个月大的时候连续喂3个月含2%消胆胺树脂的食物。2.小鼠肝脏的形态学分析:对肝脏进行大体观察,石蜡切片进行H&E染色, BrdU染色, TUNEL染色和α-fetoprotein免疫组化染色后镜下观察。3.从小鼠肝脏抽提出总RNA后,用实时定量PCR的方法检测基因IFNγ,TNFα,IL-6 NTCP, CYP7a1, CYP8b, SHP, CyclinD1和CyclinE1的表达。4.采集小鼠的血清,用胆酸L3K测定法检测总胆酸量。血清标本送至City of Hope Helford Research Hospital进行ALT的检测。第二部分1.对8至10周雄性的野生型小鼠,FXR-/-小鼠和SHP-/-小鼠施行70%肝脏切除术。特殊食物喂养的小鼠,从术前5天就开始喂含0.2%胆酸或2%消胆胺树脂的食物,一直持续至术后被处死.2.从小鼠肝脏抽提出总RNA后,用Northern Blot和/或实时定量PCR的方法检测基因Cyp7a1, SHP, PXR, c-jun的表达。3.从小鼠肝脏抽提出总蛋白后,用Western blot检测总JNK,磷酸化JNK,总c-jun和磷酸化c-jun的表达[结果]第一部分1.年老的FXR-/-小鼠自发地发生肝脏肿瘤2.年老的FXR-/-小鼠肝脏出现肿大,变性,坏死,凋亡,炎症反应等损伤性病理变化。3.年老的FXR-/-小鼠肝脏出现活跃的增生现象。4.年老的FXR-/-小鼠肝脏中促炎因子基因的表达明显增高。5.年老的FXR-/-小鼠肝脏和血清中胆酸水平增高,与胆酸代谢相关的基因发生改变。6.含0.2% CA的食物对经过DEN处理的野生型小鼠肝脏有显著的促进肿瘤生成的效果。喂含2%消胆胺树脂食物的年老FXR-/-小鼠肝脏中,肿瘤的数目和大小都显著减少。第二部分1.在小鼠70%肝脏切除术后肝脏再生过程中,胆酸信号以负反馈的形式调节Cyp7a1基因的表达。2.在小鼠肝脏再生的早期,非依赖FXR或SHP的通路参与胆酸介导的Cyp7a1基因表达的抑制。在肝脏再生的相对晚期,Cyp7a1基因转录的调节可能是通过依赖FXR和SHP的途径来实现。3.在小鼠肝脏再生的急性期,胆酸信号通过同时激活依赖FXR和非依赖FXR的通路来抑制Cyp7a1基因的表达。4.在小鼠肝脏再生的急性期,JNK信号通路以非依赖FXR的形式被激活。5. 70%肝脏切除术后1小时,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏中的SHP mRNA水平都显著增高,而在术后6小时两组小鼠肝脏中的SHP mRNA水平都明显降低。6.在肝脏再生的急性期,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏中的PXR mRNA水平都没有发生显著性改变。[结论]第一部分1. FXR-/-小鼠发生肝脏肿瘤的始动因素是由于FXR基因缺失所至的胆酸的蓄积。2.随着FXR-/-小鼠的老化,持续高水平胆酸的刺激造成了肝脏的慢性中毒性损伤和慢性炎症反应。3.在损伤修复过程中,炎症细胞的弥漫浸润,促炎细胞因子的异常表达,细胞周期的失调,细胞分裂和凋亡的失衡是引起肝脏实质和间质的异常增殖最终导致肿瘤发生的重要原因。4. FXR-/-小鼠为研究肝脏代谢和肝脏肿瘤发生之间的联系的分子机制提供了很好的动物模型。第二部分1.在小鼠70%肝脏切除术后再生的不同阶段,胆酸信号通过不同的分子机制来反馈抑制Cyp7a1基因的转录。在再生的早期,胆酸信号通过同时激活依赖FXR和非依赖FXR的通路来抑制Cyp7a1基因的表达。在再生的晚期, Cyp7a1基因表达的调控可能主要通过依赖FXR和SHP的途径来实现。2.在小鼠肝脏再生的急性期,胆酸信号激活的非依赖FXR的JNK通路可能参与抑制Cyp7a1基因的表达。这条通路可能以快速而短期的调节方式,对术后急剧增加的胆酸负荷做出强烈抑制Cyp7a1基因转录的反应。3.在小鼠肝脏再生的急性期,SHP可能同时通过FXR介导的和JNK介导的通路参与抑制Cyp7a1基因的表达。SHP通过自我负反馈机制来调节自身的表达。4.在小鼠肝脏再生的急性期,胆酸介导的Cyp7a1基因表达的抑制可能不是通过PXR信号通路来实现。