第一部分单核—巨噬细胞促进头颈鳞癌细胞侵袭性伪足形成目的:单核—巨噬细胞在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。本研究旨在探讨单核-巨噬细胞和肿瘤细胞的相互作用是否可以促进头颈部鳞状细胞癌侵袭性伪足的形成,以及两者之间相互作用的分子机制。方法:单核细胞株THP-1和HNSCC细胞株(Cal27、Fadu)直接和间接共培养体系的建立。利用细胞因子的表达、流式细胞术分析单核-巨噬细胞THP1的分化与极化。利用MTT、划痕实验及Transwell实验分析Cal27、Fadu细胞的生长、迁移和侵袭能力。此外,用免疫荧光双染的方法观察与THP1细胞共培养的Cal27细胞侵袭性伪足的形成。利用qPCR、Western Bolt和Elisa方法测定及分析参与Cal27和THP1之间交互作用的细胞因子,并使用其特定的抑制剂进一步证明细胞因子之间的相互作用的分子机制。利用低浓度姜黄素抑制共培养体系中Cal27和THP1的相互作用,并检测共培养体系中相关的细胞因子,以及肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。结果:与Cal27细胞共培养的THP1细胞有显著的基因表型的改变,M2型巨噬细胞标记分子(Arg1,Fizz1,Mgl1和Mg12)明显上调,Ca127细胞诱导THP1细胞黏附、聚集,以及分化成M2型巨噬细胞;与Cal27细胞共培养的THP1细胞高水平的表达趋化因子受体CXCR4和CCR2,而共培养的Cal27细胞则高水平的表达趋化因子SDF-1 α和CCL-2。与此同时,经THP1细胞诱导的Cal27细胞经划痕实验和transwell实验显示细胞的迁移和侵袭能力的增强。FACS分析表明单核-巨噬细胞中EGF的表达明显升高,这可能是Ca127细胞侵袭和迁移能力增强的主要原因。在其共培养体系中分别加入CCR-2和EGFR的抑制剂,可以显著的抑制THP1细胞黏附和分化,以及Cal27细胞侵袭性伪足的形成,从而抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移。低浓度姜黄素可以抑制共培养体系中Ca127和THP1细胞的相互作用,同时下调CCL2/EGF细胞因子的表达,抑制肿瘤细胞侵袭性伪足的形成。结论:HNSCC可以招募和诱导单核细胞的黏附与分化,同时单核-巨噬细胞亦可以促进头颈鳞癌细胞侵袭性伪足的形成,从而增强HNSCC的迁移和侵袭能力,这可能与CCL2/EGF旁分泌环密切相关。第二部分肿瘤相关巨噬细胞诱导口腔鳞癌上皮间充质转化目的:肿瘤细胞上皮间充质转化在肿瘤的恶性发展中起到重要作用。本部分研究旨在探讨肿瘤相关巨噬细胞是否可以促进口腔癌上皮间充质的转化,以及明确在上述过程中发挥主要作用的相关信号通路。方法:利用免疫组织化学和免疫组织荧光的方法检测口腔癌中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)标记分子和上皮间充质转化相关蛋白的表达。统计学分析TAMs数量和EMT两者的相关性。选择口腔癌细胞株(Ca127、OSCC15和OSCC25)和人外周血的单核细胞系THP1,采用经典方法诱导THP1细胞极化为M2型巨噬细胞;建立OSCC和M2型巨噬细胞直接和间接共培养体系。利用细胞因子的表达、流式细胞分选共培养体系中的TAMs和OSCC。利用免疫荧光、qRT-PCR和Western Bolt方法检测肿瘤细胞EMT相关基因和蛋白的表达变化。利用Western Bolt方法测定及分析EMT相关信号通路的活化,并使用其特定的抑制剂进一步证明TAMs诱导肿瘤细胞EMT主要的信号通路。利用免疫荧光、划痕实验及Transwell实验分析特异性抑制剂对Ca127细胞的生长、迁移和侵袭能力的影响。此外,用免疫组化方法结合聚类分析Erk1/2信号通路的活化、TAMs数量和EMT相关蛋白在口腔癌中表达的相关性。结果:在口腔癌中,肿瘤相关巨噬细胞标记物表达较高的部位,EMT相关蛋白的表达明显升高,两者具有正相关性。在细胞实验中,与M2型巨噬细胞共培养的Cal27 细胞 EMT 相关蛋白(a-SMA、Vimentin、Slug、Snail、Twist)表达明显上调,而上皮细胞标记物E-cadherin表达下调;与Ca127细胞共培养的M2型巨噬细胞分泌的生长因子(EGF,TGF-β)表达显著升高;与M2型巨噬细胞共培养的Cal27细胞Erk1/2信号通路的活性显著增强;在共培养体系中加入Erk1/2特异性抑制剂(U0126),结果显示肿瘤细胞的EMT相关因子表达明显下调;与此同时,加入U0126的共培养体系中,划痕实验和Transwell小室实验显示Ca127细胞的迁移和侵袭能力下降。免疫组化和聚类分析显示P-Erk1/2和CD163、EGFR、Vimentin、Slug 具有相关性。结论:在口腔癌中,TAMs和肿瘤细胞EMT具有显著正相关性,TAMs可以诱导0SCC细胞上皮间充质转化,并且Erk1/2信号通路可能在上述过程中发挥主要作用。