论文部分内容阅读
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是目前研究最深入的杀虫微生物，其杀虫蛋白基因也是应用最广泛和最有发展潜力的抗虫基因，因此，深入发掘Bt新菌株、分离克隆新型的杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。近年来，鞘翅目害虫尤其是金龟甲科害虫的危害日趋严重，由于其幼虫（俗称蛴螬）生活在土壤中，给防治带来很大的困难，本研究从本实验室保存的菌株中筛选高毒力野生菌株，并从中分离克隆对金龟甲科害虫有效的新型杀虫蛋白基因，研究该基因的表达和杀虫活性，为构建高效广谱的Bt工程茵和培育转基因抗虫植物提供新型基因资源。本研究的主要内容和结果如下:
1利用杀鞘翅目Bt杀虫蛋白基因通用引物S5un8/S3un8对本室保存的66株Bt菌株进行PCR检测，其中菌株B-DLL和B-JJX扩增出1.2 kb的阳性片段。生物测定结果表明，在浓度6.7μg/g时，B-DLL和B-JJX对3日龄华北大黑鳃金龟幼虫14d的校正死亡率分别为83.4％和60.0％，对暗黑鳃金龟幼虫14d的校正死亡率分别为83.3％和76.7％;在浓度为89.8μg/mL时，B-DLL和B-JJX对柳蓝叶甲3龄幼虫96 h的校正死亡率为33.3％和46.7％。菌株B-DLL晶体近圆形，B-JJX晶体近方形;SDS-PAGE分析显示，菌株B-DLL和B-JJX伴孢晶体主要为130 kDa的蛋白;Bt cry基因型PCR-RFLP鉴定结果表明，两株Bt均含有新的cry8类基因。
2以Bt菌株B-JJX质粒DNA为模板，根据GenBank中公布的cry8类基因序列，设计了一对特异性引物JJX5/JJX3，PCR扩增出3.5 kb的目的片段，将其克隆到载体pBluescript SK(+)，经测序分析表明，该基因的编码框由3543个碱基组成，编码的蛋白质由1180个氨基酸残基组成，蛋白分子量133.3 kDa。该基因的核苷酸序列已经在GenBank登录（Accession number: EU044830），提交国际Btδ-内毒素命名委员会并被确认为一个新的杀虫蛋白基因，正式命名为cry8Ab1。
3将cry8Ab1基因连接到Bt表达载体pSXY422b上，获得重组质粒pSXY-cry8Ab1，电击转化Bt无晶体突变株HD73-cry，筛选获得阳性转化子。该基因能在无晶体突变株中形成小方形晶体，SDS-PAGE检测证实，有130 kDa的蛋白存在。cry8Ab1表达产物生物测定结果表明，在浓度6.7μg/g时，对3日龄华北大黑鳃金龟幼虫14d的校正死亡率分别为58.4％，对暗黑鳃金龟幼虫14d的校正死亡率分别为84.0％。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)几丁质酶ChiA基因表达产物对cry8Ab1具有增效作用，在蛋白浓度6.7μg/g，AcMNPV ChiA浓度6μg/mL时，增效率为19.0％。