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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节炎症、滑膜增生、软骨降解、骨侵蚀和血管翳为特征的系统性自身免疫疾病,随着病程的发展最终导致关节畸形和功能丧失。随着人们对RA机体全身的异常免疫学机制的深入研究,越来越多的学者注意到滑膜本身病变在关节炎发病机制中发挥的重要作用。RA炎性条件下,炎性因子异常分泌及成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviosytes,FLS)异常增殖引起滑膜组织的异常增生,异常增殖的FLS分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可增加血管通透性,促进新血管形成。新形成的血管将炎症细胞运送到滑膜炎症部位,同时为滑膜提供营养和氧气,维持慢性炎症状态。近年来有文献报道,胶原三螺旋重复蛋白-1(collagen triple helix repeat containing-1,CTHRC1)在小鼠实验性关节炎及RA滑膜组织中高表达,特异性表达在滑膜内膜及骨-血管翳界面,可减少胶原沉积,促进细胞迁移,参与血管损伤修复、血管重构及成骨细胞形成过程。在RA滑膜组织标本中WNT5A(Wingless/Integrated 5A)和其受体卷曲蛋白5(Frizzled 5,Fzd5)的表达水平较高,CTHRC1作为WNT信号的分泌调节因子,可与WNT-Fzd5-LRP5/6形成复合物激活细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK),磷酸化的ERK通过激活核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)促进缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达,从而导致VEGF的高表达,参与血管的生成。目前,治疗RA的药物主要包括甾体抗炎药、非甾体抗炎药、疾病调修药和生物制剂。甲氨蝶呤作为治疗RA的首选药物,其治疗作用明确,但仍存在肝脏损害、肺部病变和骨髓抑制等不良反应,不利于长期治疗。依那西普作为疗效明显的生物制剂,可以竞争性阻断TNF-α与细胞表面受体结合,抑制炎症进程,但仍存在皮肤局部不良反应,并且治疗疗程长费用高,适用于难治性RA重症的患者。因此探究新的特异性治疗靶点对RA发病机制的进一步探索有着重大意义。免疫球蛋白D(Immunoglobulin D,Ig D)是1965年发现的免疫球蛋白,包括分泌型Ig D(secreted Ig D,s Ig D)和膜结合型Ig D(membrane Ig D,m Ig D),虽然Ig D体内含量特别低,但在自身免疫疾病中发挥重要作用。临床发现RA、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、干燥综合征(Sjogren’s syndrome,SS)等自身免疫疾病患者血清中的s Ig D水平较高,并且检测到许多RA患者的抗Ig D自身抗体浓度增加。在建立的Ig D转基因小鼠模型中发现小鼠的皮肤出现溃疡,肝、脾、肾均出现异常肿大,可能与血清中s Ig D高表达有很大关系。根据以上发现推测高水平的Ig D可能会导致炎症和免疫性组织损伤,因此Ig D在自身免疫疾病中发挥重要作用。1980年在人类外周血T细胞和非T细胞上发现有免疫球蛋白D受体(immunoglobulin D receptor,Ig DR)存在,而后在小鼠T细胞上也发现了Ig DR。s Ig D通过与Ig DR特异性结合发挥免疫调节功能。课题组前期研究发现:RA患者外周血中s Ig D和m Ig D水平均高于健康对照者,且RA患者血清中高水平的s Ig D与其血清中人可溶性核因子κB受体活化因子配基、类风湿因子和C反应蛋白水平正相关,提示s Ig D可能是治疗RA的一个有效的生物靶点。基于对Ig D的一些研究背景和结果,课题组构建、纯化了Ig D-Fc-Ig融合蛋白。以Ig D/Ig DR为靶点,将人Ig D-Fc段与人Ig G-Fc段连接并合成了融合蛋白Ig D-Fc-Ig,旨在特异性阻断Ig D/Ig DR通路,调控表达Ig DR的细胞功能,以治疗RA。课题组前期研究发现Ig D-Fc-Ig融合蛋白对实验性关节炎T细胞增殖分化有明显抑制作用,可通过调控T细胞上Ig D-Ig DR-Lck信号通路对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)发挥治疗作用,并且发现RA患者FLS上存在特异性膜Ig DR,Ig D可促进FLS增殖。根据以上发现提出以下假设:Ig D是否能与FLS上的Ig DR结合,促进FLS的异常活化?异常激活FLS是否与WNT信号通路的激活有关?Ig D-Fc-Ig能否阻断Ig D与Ig DR的结合,调控WNT信号通路,抑制FLS的异常活化?本课题拟以大鼠FLS和人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞株(MH7A)为研究对象,用Wistar雄性大鼠建立CIA模型,观察Ig D能否通过与Ig DR结合调控FLS中WNT-Fzd5-CTHRC1-NF-κB信号通路活化参与滑膜炎症,阐明Ig D-Fc-Ig融合蛋白可能通过抑制WNT-Fzd5-CTHRC1-NF-κB信号通路改善滑膜炎症影响从而对大鼠CIA发挥治疗作用。体外选用MH7A细胞研究Ig D是否通过Ig DR信号促进WNT-Fzd5-CTHRC1-NF-κB信号通路活化以及Ig D-Fc-Ig融合蛋白对这条通路的作用。该研究为进一步揭示RA发病机制,阐明Ig D-Fc-Ig融合蛋白治疗RA的作用特点和机制提供实验依据。目的:研究Ig D能否通过与Ig DR结合调控FLS中WNT-Fzd5-CTHRC1-NF-κB信号通路活化参与滑膜炎症,阐明Ig D-Fc-Ig融合蛋白可能通过影响滑膜炎症对大鼠CIA发挥治疗作用,Ig D-Fc-Ig融合蛋白可能通过抑制WNT-Fzd5-CTHRC1-NF-κB信号通路改善滑膜炎症。方法:1.选用Wistar雄性大鼠,建立CIA模型。大鼠随机分为6组:正常组、模型组、Ig D-Fc-Ig融合蛋白(1 mg/kg)组、Ig D-Fc-Ig融合蛋白(3 mg/kg)组、Ig D-Fc-Ig融合蛋白(9 mg/kg)组和依那西普(3 mg/kg)组,每组8只。称重后计算给药量,按照尾静脉方式,3天一次,给药6周。正常组与CIA组按照同种方式注射生理盐水。2.每3天对大鼠进行称重,并测量3次足趾肿胀容积并记录,取平均值以减小误差,同时由一个固定的实验人员对大鼠进行整体指标(全身评分、关节炎指数和关节肿胀数)评估,并记录。关节组织进行HE染色,观察病理学变化并对滑膜组织增生,炎性细胞浸润,血管翳形成和软骨组织破坏等相关指标进行评分。3.免疫组织化学技术检测关节滑膜组织中CTHRC1和VEGF的表达水平。4.免疫荧光法检测大鼠滑膜细胞上Ig DR的表达。5.蛋白免疫印迹方法检测大鼠滑膜细胞中CTHRC1、Fzd5、p-P65和P65的蛋白表达。6.免疫荧光法检测大鼠滑膜细胞上CTHRC1与Fzd5蛋白的共定位。7.体外实验:选用人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞株MH7A为体外研究对象,免疫荧光法检测MH7A上Ig DR的表达。8.CCK-8法检测WNT刺激MH7A增殖的最适浓度及最佳时间。9.蛋白免疫印迹方法检测MH7A中CTHRC1、Fzd5、p-P65、P65和VEGF的蛋白表达。10.免疫荧光法检测MH7A上CTHRC1与Fzd5蛋白的共定位。11.酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测MH7A培养上清中VEGF的水平。结果:1.Ig D-Fc-Ig融合蛋白抑制CIA大鼠滑膜炎症,对CIA大鼠有治疗作用对不同炎症时期CIA大鼠足爪炎症指标变化进行评估、分析,结果显示Ig D-Fc-Ig融合蛋白明显降低CIA大鼠关节炎指数、足爪肿胀数、足爪肿胀容积及全身评分。2.Ig D-Fc-Ig融合蛋白改善CIA大鼠关节组织病理变化采用HE染色法检测CIA大鼠关节病理变化。结果显示,与正常组大鼠相比,CIA模型组大鼠关节切片中滑膜层数明显变多并且排列紊乱,滑膜细胞异常增殖,大量炎性细胞浸润及血管翳形成,软骨组织明显被侵蚀,出现炎性细胞浸润;与CIA模型组关节比较,Ig D-Fc-Ig融合蛋白(9 mg/kg)和依那西普能明显抑制CIA大鼠滑膜细胞异常增殖,软骨组织侵蚀,炎性细胞浸润及血管翳形成。3.Ig D-Fc-Ig融合蛋白下调CIA大鼠关节滑膜组织中CTHRC1,VEGF的表达水平免疫组织化学法检测CIA大鼠关节滑膜组织中CTHRC1,VEGF的表达水平。用Image-J图像分析系统进行分析,结果显示:与正常组大鼠相比,CIA模型组大鼠关节滑膜组织中CTHRC1和VEGF蛋白表达显著上调;与CIA模型组大鼠相比,Ig D-Fc-Ig融合蛋白(9 mg/kg)和依那西普明显下调了CIA大鼠关节滑膜组织中CTHRC1和VEGF蛋白表达。4.CIA大鼠滑膜细胞上有Ig DR的存在采用免疫荧光法检测CIA大鼠滑膜细胞上Ig DR的表达,用Ig D刺激间接标记Ig DR,结果显示CIA大鼠滑膜细胞上存在Ig DR。5.Ig D-Fc-Ig融合蛋白明显下调大鼠滑膜细胞中CTHRC1、Fzd5和p-P65蛋白表达Western blot法检测大鼠滑膜细胞中CTHRC1、Fzd5和p-P65蛋白表达及Ig D-Fc-Ig融合蛋白的作用。结果显示:与正常组相比,CIA模型组大鼠滑膜细胞中CTHRC1、Fzd5和p-P65蛋白表达显著上调;与CIA模型组大鼠相比,Ig D-Fc-Ig融合蛋白(9 mg/kg)和依那西普明显下调了CIA大鼠滑膜细胞中CTHRC1、Fzd5和p-P65蛋白表达。6.Ig D-Fc-Ig融合蛋白明显降低大鼠滑膜细胞中CTHRC1和Fzd5的共定位率免疫荧光法检测大鼠滑膜细胞中CTHRC1与Fzd5的共定位率及Ig D-Fc-Ig融合蛋白的作用。激光共聚焦显微镜观察结果显示:与正常组相比,CIA模型组大鼠滑膜细胞中CTHRC1与Fzd5共定位率显著上调;与CIA模型组相比,Ig D-Fc-Ig融合蛋白(9 mg/kg)和依那西普明显下调了CIA大鼠滑膜细胞中CTHRC1与Fzd5共定位率。7.人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞株MH7A细胞上有Ig DR的存在采用免疫荧光法检测MH7A上Ig DR的表达,用Ig D刺激间接标记Ig DR,结果显示MH7A上存在Ig DR。8.Ig D-Fc-Ig融合蛋白明显下调Ig D和WNT联合刺激的MH7A中CTHRC1、Fzd5、p-P65、P65和VEGF的蛋白表达Ig D(9μg/m L)和WNT5A(100 ng/m L)体外刺激MH7A细胞48h后,Western blot法检测信号通路相关蛋白表达以及Ig D-Fc-Ig融合蛋白的作用。结果显示:与control组相比,Ig D(9μg/m L)和WNT5A(100 ng/m L)单独刺激后能明显上调CTHRC1、Fzd5和VEGF蛋白水平,Ig D(9μg/m L)和WNT5A(100 ng/m L)联合刺激能明显上调MH7A中CTHRC1、Fzd5、p-P65和VEGF蛋白水平,且对以上目的蛋白的上调作用比单独刺激更加明显;与联合刺激组相比,Ig D-Fc-Ig融合蛋白(10μg/m L)和依那西普明显下调MH7A中CTHRC1、Fzd5、p-P65和VEGF蛋白的表达。这提示Ig D-Fc-Ig融合蛋白可能通过抑制WNT-Fzd5-CTHRC1-NF-κB通路,下调VEGF的表达水平。9.Ig D-Fc-Ig融合蛋白明显下调Ig D和WNT联合刺激的MH7A中CTHRC1与Fzd5蛋白的共定位率用Ig D(9μg/m L)和WNT5A(100 ng/m L)刺激MH7A细胞48h后,免疫荧光法检测各组MH7A中CTHRC1与Fzd5的共定位率及Ig D-Fc-Ig融合蛋白的作用。结果显示:与control组相比,Ig D(9μg/m L)和WNT5A(100 ng/m L)单独刺激组能明显上调MH7A中CTHRC1与Fzd5的共定位率,Ig D(9μg/m L)和WNT5A(100ng/m L)联合刺激对MH7A中CTHRC1与Fzd5的共定位率上调作用比单独刺激更加明显;与联合刺激组相比,Ig D-Fc-Ig融合蛋白(10μg/m L)和依那西普明显降低MH7A中CTHRC1与Fzd5的共定位率。10.Ig D-Fc-Ig融合蛋白明显下调Ig D和WNT联合刺激的MH7A培养上清中VEGF-A的水平用Ig D(9μg/m L)和WNT5A(100 ng/m L)刺激MH7A细胞48h后,ELISA检测各组MH7A培养上清中VEGF-A水平的变化。结果显示:与control组相比,Ig D(9μg/m L)和WNT5A(100 ng/m L)单独刺激能明显上调MH7A培养上清中VEGF-A水平,Ig D(9μg/m L)和WNT5A(100 ng/m L)联合刺激对以VEGF-A水平的上调作用比单独刺激更加明显;与联合刺激组相比,Ig D-Fc-Ig融合蛋白(10μg/m L)和依那西普明显降低MH7A培养上清中VEGF-A水平。结论:1.Ig D可通过WNT-Fzd5-CTHRC1-NF-κB通路促进滑膜细胞的活化。2.Ig D可能通过滑膜细胞表面的Ig DR,间接的激活WNT通路促进滑膜细胞的活化。3.Ig D-Fc-Ig可能通过阻断Ig D与Ig DR的结合,间接的抑制CTHRC1与WNT受体Fzd5形成复合物,进一步抑制核转录因子NF-κB,下调VEGF的合成及分泌,达到治疗滑膜炎症的目的。