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目的:本试验以研究哈萨克羊季节性发情的调控机制为目的,通过生物信息学的方法筛选,以期得到与非繁殖季节哈萨克羊卵巢发育相关的差异microRNA及基因,研究靶基因的生物学功能,并在细胞水平上进行验证,深入探讨其在非繁殖季节哈萨克羊的卵巢发育的调控机制,为丰富绵羊季节性发情的分子机制奠定基础。方法:(1)本课题组前期建立了以非繁殖季节乏情绵羊(AN)为对照组,以非繁殖季节发情绵羊(EN)为实验组的卵巢(O)组织microRNA文库和mRNA文库。通过生物信息学的方法分析miRNA文库数据筛选得到差异性表达的miRNA,预测其靶标基因;将预测结果与mRNA文库进行深度挖掘联合分析筛选获得差异表达的靶标基因。(2)构建MAPK8基因野生型和突变型双荧光素酶载体,验证miR-200c对靶基因MAPK8的靶向调控作用。(3)在绵羊卵巢颗粒细胞中转染miR-200c mimics和miR-200c mimics inhibition,用实时荧光定量PCR检测靶基因MAPK8和部分差异表达的发情相关基因mRNA表达水平变化。(4)在哈萨克羊卵巢颗粒细胞中转染miR-200c mimics、miR-200c mimics NC及miR-200c mimics inhibition,用ELISA试剂盒检测卵巢颗粒细胞培养液中生殖激素雌二醇(E2)、孕酮(P4)的表达量,以此来研究miR-200c介导MAPK8基因在哈萨克羊发情机制中的作用。结果:(1)根据生物信息学联合分析筛选得到的结果,发现MAPK8可能是miR-200c的靶标基因。(2)转染miR-200c mimics后能使MAPK8基因的WT型质粒的活性表达显著下降,Mut型无显著变化。说明oar-mir-200c与MAPK8基因间存在靶向关系。(3)卵巢颗粒细胞在miR-200c过表达后,MAPK8基因的表达量明显下降,差异显著(P<0.05),其上游基因FZD3极显著上调(P<0.01),PRKCB基因的表达量极显著下调(P<0.01),下游基因JUN表达量明显上升,差异性显著(P<0.05)以及GNAQ表达量同样上升,差异性极显著(P<0.01)(4)卵巢颗粒细胞在miR-200c过表达后,试验组E2激素分泌量随时间的推移先上升后降低总体相对于空白对照组较高,试验组的P4分泌量随时间的推移先升高后恢复至正常水平值。结论:(1)筛选确认miR-200c和MAPK8的靶标关系。(2)通过miR-200c mimics和miR-200c抑制剂处理后,发现靶基因MAPK8表达量显著下降;(3)试验组E2激素随时间的推移分泌量先上升后降低总体相对于空白对照组较高,试验组P4分泌量随时间的推移先升高后恢复至正常水平值。