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【目的】由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),一直是危害养猪业最为严重的传染病之一,给国内外养猪业带来巨大的经济损失。为在分子水平上研究PRRSV与宿主的相互作用及其致病机制,本试验构建含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的PRRSV感染性克隆,并分析了重组PRRSV的某些特性。【方法】依据北美II型PRRSV病毒株(Gen Bank:AY545985.1)的序列,以其感染性克隆重组质粒(p FL12)和含有gfp基因的质粒(pc DNA-EF1-GFP)为模板,采用重叠PCR的方法,扩增出上、下游含有PRRSV非结构蛋白2(Nsp2)基因片段的gfp基因,并通过Spe I和Xho I位点将其插入到p FL12的PRRSV Nsp2基因中,并与其融合,构建成含gfp基因的PRRSV感染性克隆重组质粒p FL12-GFP。重组质粒经限制性内切酶Acl I酶切线性化后,经蛋白酶K/SDS处理,酚/酚氯仿抽提和乙醇沉淀,得到纯化的线性的p FL12-GFP。利用m MESSAGE m MACHINE体外转录试剂盒,在T7 RNA聚合酶的催化下,合成含有5′帽子结构的GFP-PRRSV m RNA。然后利用酵母Poly(A)聚合酶对5′端帽子结构的GFP-PRRSV m RNA进行加尾,使其变为成熟的GFP-PRRSV m RNA,即5′端带有帽子结构和3′端带有Poly(A)尾的GFP-PRRSV m RNA。用Transmessenger Transfection试剂将GFP-PRRSV m RNA转染仓鼠肾(BHK-21)细胞进行病毒的包装,然后用其细胞裂解液上清感染Marc-145细胞扩增重组病毒,感染48h后,用荧光显微镜观察GFP荧光及PCR方法扩增含gfp基因的Nsp2基因片段确定确实拯救出了含gfp基因的重组PRRSV GFP-PRRSV。然后用亲本PRRSV和拯救出的GFP-PRRSV感染Marc-145细胞和猪的肺泡巨噬(PAMs)细胞,并对其感染性和复制能力进行初步分析。【结果】采用重叠PCR的方法将gfp基因成功地插入到了Nsp2基因的特定位点上,并与其融合,构建成含gfp基因的PRRSV感染性克隆重组质粒FL12-GFP。然后将PRRSV感染性克隆重组质粒进行体外转录生成GFP-PRRSV m RNA,先后转染BHK-21和感染Marc-145细胞,成功地拯救出表达GFP的重组GFP-PRRSV。经分析表明,制备的重组GFP-PRRSV与亲本PRRSV一样均能感染Marc-145细胞和猪肺泡巨噬细胞(PAMs),在Marc-145细胞中的增殖速度高于在PAMs细胞中;GFP-PRRSV在两种细胞中的增殖速度与亲本PRRSV相比都有所下降,但未达到显著水平。【结论】利用重叠PCR策略将gfp基因插入PRRSV感染性克隆的Nsp2基因中并与其融合,成功构建出表达GFP的PRRSV感染性克隆。与亲本PRRSV相比,本实验构建的表达GFP的PRRSV感染性克隆的感染性没有显著差异,为将来PRRSV的研究创造了有利条件。