肝纤维化(liver fibrosis)是对包括病毒、自身免疫、药物、酒精、胆汁淤积以及代谢性疾病在内的各种病因所致的慢性肝损伤的修复反应，是一种以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积为特征的病理生理过程，它是多种慢性肝病发展演变为肝硬化的必经阶段。目前认为肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化与增殖是肝纤维化发生的关键环节，活化的HSC是细胞外基质的主要来源，并能产生大量致纤维化细胞因子，在肝纤维化发展过程中起重要作用。而乙醇的代谢产物—乙醛作为有效刺激信号可以活化HSC内多条与HSC生物学行为有关的信号传导通路，在调控HSC活化、增殖、细胞外基质分泌等方面起重要作用，是导致酒精性肝纤维化发生的关键因素。　　近年来有不少的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路与肝星状细胞的活化及肝纤维化的发生密切相关，而丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)包括ERK、JNK、P38信号通路也是调控HSC活化与增殖导致肝纤维化发生的主要信号传导通路之一。Wnt/β-catenin和MAPK/ERK信号通路对HSC的DNA合成、细胞生存和ECM合成发挥关键作用，阻断任一途径皆可抑制HSC增殖和ECM分泌，进而阻止肝纤维化的进展。　　普罗布考(Probucol)，又名丙丁酚，最初以降脂药应用于临床，主要降低血清胆固醇，随着对其药理作用的认识不断深入，发现其有抗氧化及抗动脉粥样硬化作用，最近的研究还发现它在内膜细胞和系膜细胞具有抗增殖作用。已有研究证实，普罗布考对增殖信号通路Raf/MEK/ERK有明显抑制作用且能够显著下调p-ERK1/2的水平，从而抑制阿霉素导致的心肌纤维化。另一项研究表明，普罗布考能够通过抑制JAK2/STAT途径的活化，减低TGF-β1和CTGF等细胞因子的表达，从而减少高糖诱导的人肾小球系膜细胞ECM积聚。晚近一项研究提示普罗布考通过降低肝脏氧化应激水平而减轻四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化，但有关普罗布考对wnt/β-catenin信号通路的影响及其对酒精性肝纤维化保护作用的机制国内外尚未见报道。　　目的：　　基于这些发现，我们假设普罗布考可以抑制HSC的增殖和细胞外基质的分泌，是一种潜在的治疗肝纤维化的新选择。为了证明这一假设，我们建立酒精性肝纤维化的细胞模型进行以下实验:观察普罗布考是否能够抑制乙醛诱导的HSC-T6细胞的增殖;明确普罗布考对乙醛刺激后细胞周期各时相及其相关的蛋白和激酶抑制剂的影响;同时观察普罗布考是否能够抑制乙醛诱导的HSC-T6细胞的活化及分泌细胞因子的影响并探讨其作用的分子机制。　　方法：　　1、体外培养大鼠HSC-T6细胞株，cck8法检测普罗布考(终浓度20，40，80，160μmol/L)对乙醛(终浓度200μmol/L)刺激的HSC增殖的影响。　　2、免疫细胞化学法检测普罗布考(终浓度40，80μmol/L)对乙醛刺激的HSC-T6细胞cyclinD1、 p27kip1、α-SMA和FN蛋白表达的影响。　　3、流式细胞术检测普罗布考(终浓度40，80μmol/L)对乙醛刺激的HSC-T6细胞周期分布的影响。　　4、实时荧光定量PCR法检测普罗布考对HSC-T6细胞α-SMA、FN、CTGF和PAI-1等细胞因子表达。　　5、Western blot法检测普罗布考对HSC-T6细胞因子CTGF，PAI-1和信号转导通路相关蛋白β-catenin，磷酸化GSK-3β和ERKI/2等蛋白表达的影响;检测乙醛作用不同时点对HSC-T6细胞核β-catenin蛋白表达的影响;检测100ng/ml Dkk1和50μmol/L PD98059对乙醛刺激的HSC-T6细胞α-SMA和cyclinD1蛋白表达的影响。　　结果：　　1、200μmol/L的乙醛可以促进HSC-T6细胞的增殖，12h、24h和48h细胞相对增殖率分别为117.91％，124.44％、135.01％，在48h促细胞增殖作用最为明显。不同浓度的普罗布考在各时点对HSC-T6细胞的增殖具有不同程度的抑制作用，随着药物浓度和作用时间的增加，抑制率增高，具有一定的时间和浓度依赖性。在48h时20、40、80和160μmol/L普罗布考对乙醛刺激的HSC-T6的抑制率分别为16.45％、31.44％、75.12％和83.55％。　　2、流式细胞学检测结果显示200μmol/L的乙醛促使HSC-T6细胞由G0/G1期向S期转换，S期细胞与正常对照组比较有显著性差异(46.02±3.04 vs22.18±3.21P＜0.01)。普罗布考作用HSC-T6细胞24小时后，使G0/G1期细胞比例上升，而S期细胞比例下降，且呈剂量依赖性。普罗布考阻断HSC细胞由G0/G1期向S期转变，从而抑制细胞DNA合成，抑制细胞分裂，使细胞周期进程减缓，阻止其发生增殖。　　3、细胞免疫化学结果显示，与乙醛刺激组比较，普罗布考处理后，随着普罗布考浓度的增加，cyclinD1蛋白表达强度呈逐渐减弱趋势，而p27kip1蛋白表达强度呈逐渐增强趋势，有显著性差异;RT-PCR结果显示，与对照组比较，乙醛组cyclinD1 mRNA的表达明显增强;经普罗布考处理后，随着普罗布考浓度的增加，cyclinD1表达呈逐渐减弱趋势，与对照组比较，乙醛组p27kip1mRNA的表达明显减弱;经普罗布考处理后，随着普罗布考浓度的增加，p27kip1表达呈逐渐增强趋势，有显著性差异。　　4、免疫细胞化学结果显示，与乙醛刺激组比较，普罗布考处理后，随着普罗布考浓度的增加，α-SMA和FN蛋白表达强度呈逐渐减弱趋势。RT-PCR结果显示，与对照组比较，乙醛组α-SMA和FN mRNA的表达明显增强;经普罗布考处理后，随着普罗布考浓度的增加，α-SMA和FN mRNA表达呈逐渐减弱趋势。　　5、Westem blot及RT-PCR结果显示，与对照组比较，乙醛组CTGF和PAI-1蛋白及mRNA的表达明显增强;经普罗布考干预后，随着普罗布考浓度的增加，CTGF和PAI-1蛋白及mRNA的表达呈逐渐减弱趋势，各组间有显著差异。　　6、乙醛呈时间依赖促进β-catenin蛋白的表达。Wnt抑制剂Dkk1(100ng/ml)和ERK阻滞剂PD98059(50μmol/L)均可以抑制乙醛刺激的HSC-T6细胞的增殖和活化。　　7、普罗布考干预24 h后明显抑制了乙醛诱导的HSC-T6细胞核β-catenin的表达，同时抑制了GSK-3β和ERK1/2的磷酸化。　　结论：　　1、普罗布考呈浓度与时间依赖性抑制乙醛刺激的HSC-T6细胞的增殖，且它抑制因乙醛活化而升高的细胞周期相关蛋白cyclinD1的表达，同时上调周期蛋白依赖蛋白激酶抑制剂P27kip-1的表达，调控细胞周期停滞于G0/G1期，从而发挥抑制大鼠肝星状细胞增殖的作用。　　2、普罗布考呈剂量依赖方式抑制乙醛诱导的肝星状细胞α-SMA和FN mRNA及蛋白的表达。同时普罗布考还可以抑制乙醛诱导的HSC-T6细胞因子CTGF和PAI-1mRNA及蛋白的表达。　　3、普罗布考可能通过阻断MAPK信号转导途径相关因子ERK1/2蛋白的磷酸化，进而抑制HSC-T6细胞内Wnt/β-catenin信号通路，降低GSK-3β蛋白磷酸化水平及下调β-catenin蛋白的表达，从而抑制外源性乙醛刺激的HSC-T6的增殖和活化。