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维生素D又称抗佝偻病维生素,对维持人体内钙的动态平衡起着十分重要的作用,能与钙一起促进儿童骨骼的形成和维持成人骨骼的强度。25羟基维生素D（25（OH）VD）是衡量人体内维生素D营养状态的最佳指标,临床上对人体血清中25（OH）VD进行定量检测,能够及时反应人体维生素D的营养状况,对维生素D缺乏患者的预防及治疗都有重要的意义。免疫层析试纸条具有操作简单、检测速度快、灵敏度高和特异性强等优点,在临床免疫学检测方面得到了快速发展。本研究初步建立了胶体金免疫层析方法快速定量检测25（OH）VD的含量。具体研究内容如下:以25（OH）VD为原料,利用DCC/NHS活泼酯法制备了25（OH）VD-BSA和25（OH）VD-OVA全抗原,通过薄层色谱法对反应过程进行监控,采用紫外可见光分光光度法对25（OH）VD-BSA和25（OH）VD-OVA进行了表征。以25（OH）VD-BSA为免疫原免疫小鼠,利用酶联免疫吸附法（ELISA）从小鼠二次免疫开始,监控小鼠抗血清效价。第四次免疫后进行冲击免疫,取阳性小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合,经过对融合细胞进行“筛选-克隆-筛选”等一系列操作后,得到能分泌抗25（OH）VD单克隆抗体的细胞株39株。选取11株细胞株采用小鼠体内诱导法制备了相应的抗25（OH）VD单克隆抗体腹水,利用辛酸-硫酸铵法进行腹水纯化,用紫外分光光度法和间接ELISA法测定抗体浓度、抗体的亲和性及抑制率。结果表明,11种抗体对25（OH）VD的亲和性很好,效价都在8000以上,25（OH）VD加标浓度为100 ng/m L时,5种抗体的抑制率高于70%。本研究基于所制备的25（OH）VD单克隆抗体,建立了定量检测25（OH）VD的胶体金免疫层析法。试纸条的最佳工艺参数为:抗体标记p H为6.5;抗体记量为3μg/m L;免疫探针用量为3.0μL。免疫层析方法的动力学平衡时间为15min。在PBS溶液中检测25（OH）VD的线性回归方程为:y=-1.2251 log（x）+2.4593（R2=0.9877）,线性范围为5 ng/m L-60 ng/m L,灵敏度为3.65 ng/m L。本试纸条与25（OH）VD2、25（OH）VD3、1,25（OH）2VD3、1,25（OH）2VD2、VD2和VD3的交叉反应率分别为100%、99%、10%、22%、98%和8%。试纸条批内、批间加标回收率分别为85.6%-90.76%和95.83%-106.7%,变异系数分别介于7.0%-23.72%之间和7.59%-8.74%之间。尝试将本试纸条用于检测实际人血清中的25（OH）VD,发现基质效应明显,采用不同的样本前处理手段初步摸索了减少基质效应的方法。