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研究目的1-溴丙烷(1-bromopropane,1-BP),又名溴丙烷、正丙基溴等,由于其化学性质稳定、易挥发、不易燃烧、在大气中的半衰期短,对臭氧层的破坏较小等特点作为臭氧层破坏物质的替代剂,被国内外广泛应用。随着1-BP的广泛应用,职业接触人群不断增多,职业中毒也随之出现。流行病学调查和实验室研究显示1-BP具有神经毒性,相对周围神经而言,中枢神经系统(Central nervous.system,CNS)对1-BP的毒性更加敏感。目前1-BP中毒机制的研究还未完全阐明,临床上亦缺乏特效治疗药物,因此研究1-BP致CNS损伤的中毒机制,对有效预防和治疗1-BP中毒有重要的意义。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)是人体必不可少的n-3多不饱和脂肪酸,主要来自鱼油和微藻油。DHA本身的结构特点使其能够调节机体对氧化应激的生理反应,降低氧化应激损伤。研究表明DHA能够促进神经发育,具有神经保护作用。新近的研究证实,DHA有较强的抗炎作用。神经酸(Nervonic acid, NA)是一种长链单不饱和脂肪酸,主要来源于鲨鱼脑及鲨鱼油,是大脑白质中细胞膜的重要组成成分,能有效地促进神经组织的修复和再生,防止大脑神经衰老。NA具有较强的抗氧化能力,能增加SOD活性,降低MDA含量。研究显示NA对帕金森、老年痴呆等疾病也具有一定的治疗作用。本实验中,大鼠经口染毒1-BP,采用Morris水迷宫试验评价1-BP对大鼠学习记忆能力的影响；并分别给予DHA和NA干预,观察DHA和NA对1-BP导致的CNS损伤的拮抗作用。通过检测动物大脑皮层的氧化应激状态、星形胶质细胞激活情况、核因子-κB (nucler factor kappa B, NF-κB)、NF-E2相关因子2(transcription factor NF-E2-related factor-2, Nrf2)蛋白的表达初步探讨1-BP对CNS损伤的机制。研究方法1DH[A和NA对1-BP导致中枢神经系统损伤的拮抗作用40只雄性Wistar大鼠适应性喂养5d后,随机分为对照组、1-BP染毒组、DHA干预组和NA干预组,每组10只。1-BP染毒组、DHA干预组、NA干预组每天经灌胃给予800mg/kg.bw1-BP,对照组给予等体积玉米油。在给予1-BP4小时后,分别经口给予500mg/kg.bw DHA和150mg/kg.bw NA,连续12d。给予相应受试物的第8d,采用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,持续5d。水迷宫结束后次日断头处死大鼠,迅速取出大脑皮层和海马。生化法检测大脑皮层中还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量,谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)和γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(y-Glutamate cysteine ligase, y-GCL)的活性。2DHA对1-BP导致中枢神经系统损伤的拮抗机制雄性Wistar大鼠48只,适应性喂养5d后,随机分为对照组、1-BP染毒组、低剂量DHA干预组和高剂量DHA干预组,每组12只。低剂量DHA干预组和高剂量DHA干预组分别经灌胃250mg/kg.bw、500mg/kg.bw的DHA,其余各组给予等体积玉米油,连续7d。在给予DHA的第8d,1-BP组、低剂量DHA干预组、高剂量DHA干预组分别经灌胃给予800mg/kg.bw1-BP,对照组给予等体积的玉米油。给予1-BP的第8d,采用Morris水迷宫检测大鼠学习能力。连续4d,期间继续按照原剂量给予相应受试物。水迷宫结束后,立即处死动物,分离出大脑皮层进行各指标测定。生化法检测大脑皮层中GSH、MDA的含量,免疫荧光法检测大鼠大脑皮层中胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)观察星形胶质细胞的激活情况,采用western blotting检测动物大脑皮层胞浆和胞核中NF-κB、Nrf2蛋白的表达,观察其活化的变化。研究结果1DHA和NA对1-BP导致中枢神经系统损伤的拮抗作用1.1Morris水迷宫实验结果Morris水迷宫结果显示,与对照组相比,1-BP染毒组的游泳总路程和逃避潜伏期明显延长(P<0.01,P<0.05),穿越平台次数及平台周边时间／总时间明显降低(P<0.05),提示1-BP能够明显损伤实验动物的学习记忆能力。与1-BP染毒组相比,补充NA和DHA均可使大鼠的逃避潜伏期和游泳总路程明显缩短(P<0.05)；补充DHA后,动物的穿越平台次数和平台周边时间明显增加(P<0.05),NA干预组的穿越平台次数明显增加(P<0.05)；提示补充NA和DHA分别在一定程度上能够拮抗1-BP对CNS的损伤。1.2实验动物大脑皮层GSH, MDA含量和GR、γ-GCL活性与正常对照组相比,1-BP染毒组大鼠GSH含量下降了18.1%,DHA和NA能升高动物大脑皮层GSH的含量,DHA干预组与1-BP组差异具有统计学意义(P<0.05)。大鼠暴露1-BP后,MDA含量较对照组增加了14.3%,补充NA和DHA后,MDA含量明显降低(P<0.05)。与对照组相比,1-BP染毒组的GR酶活力下降,DHA干预组活力明显高于1-BP染毒组,差异具有统计学意义(P<0.05)。与1-BP染毒组相比,NA染毒组的y-GCL活力明显升高(P<0.05)。1DHA对1-BP致中枢神经系统损伤的拮抗机制通过以上实验,我们观察到DHA对1-BP导致的CNS损伤具有明显的保护作用。因此,另取一批动物观察了不同剂量DHA对CNS的保护作用,并初步探讨其作用机制。1.1Morris水迷宫实验结果定位导航实验中,1-BP染毒组动物的游泳总路程和逃避潜伏期比对照组明显延长(P<0.05),与1-BP染毒组相比,低剂量DHA干预组和高剂量DHA干预组均能明显缩短游泳总路程和逃避潜伏期(P<0.01)。2.2实验动物大脑皮层中GSH, MDA含量1-BP染毒组GSH含量明显降低,与对照组相比,1-BP染毒组的GSH含量下降了48.1%(P<0.01),与1-BP染毒组相比,低剂量DHA干预组和高剂量DHA干预组大脑皮层GSH含量分别升高了59.9%(P<0.01)、81.9%(P<0.01)。与对照组相比,1-BP染毒组动物MDA含量增加了27.0%(P<0.01),低剂量DHA干预组和高剂量DHA干预组的MDA含量分别降低了19.5%(P<0.01)、29.1%(P<0.01)。2.3实验动物大脑皮层星形胶质细胞的活化情况免疫荧光结果显示,正常对照组大鼠大脑中GFAP表达很低,1-BP染毒组大鼠大脑皮层中荧光强度升高明显,提示1-BP能够大量激活大脑的星形胶质细胞。低剂量DHA和高剂量DHA均能明显抑制1-BP导致的大脑星形胶质细胞的激活。实验同时采用Western blotting验证了大脑皮层GFAP的表达。检测结果与免疫荧光结果一致。与对照相比,1-BP大鼠皮层中GFAP蛋白表达显著升高(P<0.05),提前给予低剂量DHA和高剂量DHA干预后,与1-BP染毒组相比,大鼠大脑皮层中GFAP蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。2.4实验动物大脑皮层中NF-κB、Nrf2蛋白的表达采用Western blotting分别检测了大脑皮层细胞质和细胞核中NF-κB、Nrf2蛋白的表达,观察1-BP对动物CNS中NF-κB、Nrf2的激活情况。结果显示,1-BP染毒能够明显升高细胞质和细胞核中的NF-κB。与1-BP染毒组相比,DHA干预组大鼠大脑皮层细胞质和细胞核中NF-κB显著降低(P<0.05),其中高剂量DHA干预组细胞质NF-κB的表达比1-BP染毒组降低了53.4%(P<0.05)。1-BP暴露亦能激活Nrf2,大脑皮层的胞质和胞核中Nrf2的表达有所增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。与1-BP染毒组相比,低剂量DHA干预组和高剂量DHA干预组大脑皮层的胞质和胞核中Nrf2蛋白表达升高,与1-BP染毒组相比,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论11-BP能够导致实验动物CNS损伤,使学习记忆能力明显下降。NA(150mg/kg.bw)和DHA (500mg/kg.bw)均能拮抗1-BP导致的CNS的损伤,DHA的效果优于NA。21-BP暴露使大脑GSH含量下降,GSH生成酶GR和y-GCL的活性明显降低。NA和DHA均可增强GR和y-GCL的活性,显著升高GSH,降低1-BP导致的氧化应激。31-BP对CNS的损伤可能与AS激活相关,DHA可能通过抑制NF-κB的活化、激活Nrf2通路减轻1-BP的CNS毒性。