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研究背景及目的:胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤,严重危害人类健康。随着对肿瘤干细胞概念的提出及干细胞和肿瘤起源研究的深入,人们认识到干细胞的异常分化和增殖会导致肿瘤的发生。肿瘤的起源及致瘤性、恶性程度、耐药性、复发转移等均与干细胞基因的异常表达密切相关。Oct4及Nanog均为同源域转录因子,在进化上非常保守,且在许多生物的细胞命运分化中起关键性作用。Oct4与Nanog联合Sox2等编码的转录因子,在胚胎发育过程中起着重要的作用,是囊胚的3个谱系分化中维持他们各自的干细胞类型的关键,对这几个基因进行遗传操作可以引起这些干细胞类型之间的转变。最新的研究发现,人类表达Oct4基因的成人干细胞可能是癌变起源的靶细胞之一。明确Oct4在肿瘤中的表达情况,其与肿瘤分化程度之间的关系,可能对进一步揭示肿瘤的来源从而指导肿瘤防治具有重要意义。在多种肿瘤细胞系如MCF7乳腺癌细胞系、Hela宫颈癌细胞系中检测到有Oct4的表达,但关于胰腺癌细胞系中Oct4的表达情况没有系统的检测报道。Nanog是2003年新发现的,在胚胎发育中具有与Oct4相似的调控分化作用的转录因子,近年研究发现其在胚胎来源肿瘤中有表达,但对于Nanog在实体肿瘤中的表达至今未见相关报道。本研究旨在通过mRNA水平及蛋白水平检测三株不同分化程度胰腺癌细胞株(高分化Bxpc3、低分化Panc-1及Mia PaCa-2)中Oct4及Nanog的表达,初步揭示Oct4及Nanog表达与胰腺癌细胞分化水平的关系;并利用有限稀释法获得Panc-1细胞系单细胞克隆团,通过比较普通培养Panc-1细胞及单克隆培养后Panc-1细胞间Oct4、Nanog表达变化,初步揭示Oct4及Nanog在Panc-1胰腺癌细胞系增殖中的表达传递规律。上述研究将为进一步研究Oct4及Nanog在胰腺癌干细胞中调控作用及介导胰腺癌起源发生发展、转移侵袭等生物学行为中作用奠定基础。研究方法:1,采用荧光定量PCR检测三株不同分化程度胰腺癌细胞株(高分化Bxpc3、低分化Panc-1及Mia PaCa-2)中Oct4及Nanog基因mRNA表达水平的高低,探讨Oct4及Nanog在胰腺癌中的表达及其与肿瘤分化、恶性程度的可能关系。2,Western Blot检测三株不同分化程度胰腺癌细胞株(高分化Bxpc3、低分化Panc-1及Mia PaCa-2)Oct4及Nanog基因蛋白表达。免疫荧光验证其中Oct4及Nanog基因原位表达。3,利用单细胞克隆培养技术获得具有自我更新能力的细胞比例;通过荧光定量PCR比较普通Panc-1细胞、单细胞克隆Panc-1及第二代亚单克隆Panc-1细胞间Oct4、Nanog表达变化。研究结果:1,荧光定量PCR检测发现,三株不同分化程度胰腺癌细胞株(高分化Bxpc3、低分化Panc-1及Mia PaCa-2)均有Oct4及Nanog的mRNA表达。与内参GAPDH表达相比,Bxpc-3细胞中Oct4及Nanog表达ΔCT值分别为10.64±1.23及16.44±1.01;Panc-1细胞中Oct4及Nanog表达ΔCT值分别为10.74±1.88及15.34±2.43;Mia PaCa-2细胞中Oct4及Nanog表达ΔCT值分别为8.98±0.73及14.44±2.17.2,werstern blot验证了Oct4及Nanog蛋白在三株不同分化程度胰腺癌细胞株(高分化Bxpc3、低分化Panc-1及Mia PaCa-2)中具有表达,与荧光定量PCR结果相似,Mia PaCa-2细胞株Oct4及Nanog的表达均高于Bxpc-3及Panc-1。免疫荧光原位检测发现Oct4及Nanog定位于细胞核内,与以往研究符合。3,接种的22个单细胞中有5个可以形成细胞克隆团(22.7%)。传代后同样有限稀释法单细胞亚克隆形成率与前相似,为26.7%(4/15)。荧光定量PCR检测显示,单细胞克隆形成后细胞及亚克隆细胞Oct4表达的ΔCT值分别为10.51±0.58及9.91±0.98,Nanog表达的ΔCT值分别为14.61±2.92及14.2±1.04。与普通培养Panc-1细胞相比(Oct4 10.74±1.88,Nanog 15.34±2.43),三者之间均没有统计学差异。结论:1,三株不同分化程度胰腺癌细胞株(高分化Bxpc3、低分化Panc-1及MiaPaCa-2)中均有Oct4及Nanog的mRNA水平及蛋白水平表达。2,三株不同分化程度胰腺癌细胞株(高分化Bxpc3、低分化Panc-1及MiaPaCa-2)中,Oct4表达Mia PaCa-2高于Panc-1及Bxpc-3,且有统计学意义;Nanog表达在Panc-1及Mia PaCa-2之间没有统计学差异,而在Mia PaCa-2中表达高于Bxpc-3。Oct4及Nanog的表达高低与胰腺癌细胞株分化程度高低呈负相关,提示Oct4及Nanog表达水平可能与胰腺癌的分化程度有关。3,Oct4及Nanog表达在普通培养Panc-1及单细胞克隆、亚克隆Panc-1细胞中表达没有差异,提示其在胰腺癌Panc-1细胞系的分裂增殖过程中保持相对稳定的基因表达传递。