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第一部分野生及胞浆定位突变型P21基因真核表达载体的构建目的：构建野生及胞浆定位突变型P21基因的真核表达载体,为研究P21亚细胞定位改变对HepG2细胞周期及凋亡的影响奠定基础。方法：以含人全长的p21cDNA质粒为模板,采用大引物PCR定点诱变技术,扩增野生及核定位信号突变型P21基因,TA克隆到pMD18-T载体中,将它们用BamHI和ECoRⅠ双酶切后,以正确读码框插入到经同样酶切的真核表达载体pDsRed1-C1载体中,获得真核表达质粒pDsRed1-C1-P21WT、pDsRed1-C1-P21MT。以PCR和酶切方法筛选鉴定阳性重组质粒并测序验证。结果：构建的野生及胞浆定位突变型P21基因的真核表达载体经酶切鉴定和DNA测序,表明各基因正确地插入到真核表达载体pDsRed1-C1中,且密码子阅读框正确。结论：成功地构建了构建的野生及胞浆定位突变型P21基因的真核表达载体。第二部分P21真核表达质粒体外对HepG2细胞增殖及凋亡的影响的研究目的：观察构建的野生及突变型P21真核表达质粒亚细胞定位,P21mRNA表达水平,检测P21真核表达质粒对HepG2细胞周期及凋亡的影响。方法：利用脂质体将P21真核表达质粒转染HepG2细胞,经G418筛选获得稳定转染P21的细胞株。荧光显微镜观察P21在细胞内的亚细胞定位及分布；RT-PCR检测P21mRNA的表达情况；MTT实验检测P21亚细胞定位的改变对细胞增殖影响；经放线菌素-D (Act-D:1mg/L)凋亡诱导24h后,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率；流式细胞仪检测细胞周期改变。结果：荧光显微镜观察提示：稳定转染的细胞株,野生型组、突变型组P21融合蛋白呈团块状聚集,野生型组其荧光主要定位于细胞核,而核定位信号突变型组荧光主要定位于胞质。RT-PCR检测提示：野生型组、突变型组细胞株其细胞内均有P21mRNA高丰度的表达；MTT实验提示：突变型组细胞增殖加快,表现为曲线左移、斜率变陡(P<0.01)；野生型组细胞增殖减慢,表现为曲线右移、斜率变平(P<0.01)；各组细胞周期分析表明：野生型组HepG2细胞与突变型组相比,G0/G1细胞比例明显增加(P<0.01)；流式细胞术检测细胞凋亡率提示：突变型组：2.21；野生型组：12.30,凋亡率差异显著(P<0.01)。结论：野生型P21定位于细胞核,核定性信号突变型型P21定位于细胞浆,胞浆型P21促进HepG2细胞增殖、促进细胞周期运行、增强其抗凋亡能力。