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小麦穗发芽（Preharvest sprouting,PHS）是指小麦成熟期在潮湿环境下籽粒在穗上直接发芽的现象。穗发芽对小麦生产的负面影响主要体现在降低产量、恶化品质和降低种用价值。目前,大多数小麦品种的抗穗发芽能力都不强。解决穗发芽的途径:一是应用化学调控技术,二是选育抗穗发芽品种。培育抗穗发芽能力强的品种能很好地解决这一问题,然而小麦抗源的匮乏严重限制了抗穗发芽小麦品种的选育和应用。采用以转基因育种为代表的植物分子育种技术创制抗穗发芽新材料,是提高小麦抗穗发芽能力的理想途径之一。为充分利用RING FINGER类基因进行小麦抗穗发芽性状改良,本研究获得了与种子休眠和穗发芽有关的RsRHA2b基因,建立了高效稳定的转基因小麦创制方法,获得了转基因纯合株系。基于转基因纯合株系,研究了成熟期和萌发早期外源RsRHA2b基因的导入对小麦籽粒淀粉合成关键酶活性、蛋白质合成关键酶活性及相关基因表达的影响。以进行过不同处理的大麦种子的胚为材料构建cDNA文库,采用酵母双杂交系统筛选出与TaRHA2b蛋白互作的蛋白,探索了TaRHA2b基因的调控途径。同时挖掘并分离出抗穗发芽新基因。研究了TaRHA2b基因编码区在供体祖先及在不同品种间的分布情况,开发抗穗发芽分子标记。研究结果如下:1.转RsRHA2b基因抗穗发芽材料的创制及鉴定来自萝卜的RsRHA2b基因编码转录因子类蛋白,该蛋白与ABA信号转导有关,能影响种子休眠和穗发芽,通过种子萌发早期农杆菌介导法将RsRHA2b基因转移至小麦“郑麦9023”;通过Basta抗性筛选,PCR、RT-PCR、q RT-PCR和Southern杂交对转基因株系进行鉴定;针对纯合转基因株系,进行离体种子萌发,整穗萌发及种子萌发特性的分析;二叶期不同浓度ABA处理后,进行ABA的敏感性分析,通过q RT-PCR分析与RHA2b/ABA信号传导途径有关的ABI5,FUS3和MAL基因的表达谱。结果显示RsRHA2b基因已整合到小麦的基因组中,而且能够稳定的遗传;转基因株系的种子休眠性及抗穗发芽能力与对照组相比显著增强;不同浓度ABA处理后,转基因株系的生长量与对照组相比有显著的下降,说明转基因株系与对照组相比有更强的ABA敏感性;q RT-PCR结果显示证实转基因株系中ABI5,FUS3和MAL基因的表达量与对照组相比都显著的增加。这些结果说明RsRHA2b基因提高了转基因小麦休眠性及抗穗发芽能力。2.小麦“郑麦9023”悬浮细胞系的建立和植株再生用普通小麦“郑麦9023”的幼胚诱导愈伤组织,研究了培养基中不同浓度2,4-D、KT对愈伤组织诱导和愈伤组织继代培养的影响。发现诱导效果最好的培养基是含有3.0mg/L2,4-D的MS培养基,出愈率最高达92.5%;愈伤组织进行继代培养的最佳培养基是含有1.0mg/L 2,4-D和0.1mg/L KT的MS培养基;最佳的悬浮培养基是含有1.0mg/L 2,4-D和0.1mg/L KT的MS培养基;最佳的悬浮系继代天数为14d;悬浮系中的成熟胚在基本培养基上可以发育成正常的植株。据此,建立了快速高效的小麦遗传转化体系。3.利用酵母双杂交系统筛选与TaRHA2b互作的蛋白以混合的大麦的胚为材料,构建均一化cDNA文库;构建诱饵蛋白载体p GBKT7-TaRHA2b,转化酵母AH109细胞,进行了自激活检测;通过一对一酵母共转、二缺及四缺培养基筛选、β-半乳糖苷酶显色反应筛选候选阳性克隆;以及一对一体内再共转及体外pull down实验进行再次验证。成功构建了滴度为1.2×106cfu/m L、库容为1.1×106的大麦胚的均一化cDNA文库,插入片段大小在1000-3000bp之间;对cDNA文库进行大规模质粒提取及测序,得到了5000个质粒,获得了120个大片段的序列信息;成功构建了没有自激活功能的诱饵载体,在四缺培养基上筛出132个候选蛋白,β-半乳糖苷酶显色反应呈阳性的有84个,获得了52个有效序列信息,挑选其中的8个做了体内及体外验证,结果表明是阳性的。通过酵母双杂交体系筛选出在酵母细胞内能与TaRHA2b蛋白结合的蛋白包括YTH2450、YTH2456和YTH2476等。这些结果有利于阐述TaRHA2b基因参与调控的具体信号转导通路。4.编码互作蛋白基因的克隆及功能分析以大麦叶片来源的DNA和RNA做模板,采用RT-PCR扩增YTH2450,YTH2456和YTH2476三个基因;采用q RT-PCR对这三个基因的组织表达特异性以及ABA处理条件下的表达模式进行分析;同时分别构建了相应基因的过表达载体,进行了水稻的遗传转化和鉴定。结果表明,YTH2450和YTH2456基因没有内含子,YTH2476基因有5个内含子;三个基因均有较强的组织特异性,对ABA的响应达到显著水平;构建了三个候选基因的表达载体,成功地得到了株系,PCR结果鉴定有阳性株系。这些结果为进一步研究YTH2450,YTH2456和YTH2476三个基因自身的功能及阐明TaRHA2b和相应蛋白所形成的复合体的作用机制奠定了基础。5.外源RsRHA2b基因对小麦灌浆期关键酶活性及编码互作蛋白基因表达的影响以纯合的转RsRHA2b基因材料1477和对照小麦“郑麦9023”为材料,对灌浆期淀粉合成关键酶及蛋白质合成关键酶活性进行了研究,同时对相关基因的表达量做了荧光定量分析。结果表明,外源RsRHA2b基因的导入提高了淀粉合成关键酶SBE、SSS、AGPP、GBSS及蛋白合成关键酶GOGAT的活性,降低了蛋白合成关键酶GS的活性。同时,外源RsRHA2b基因的导入促进了YTH311、YTH611、YTH1065、YTH2437、YTH2438、YTH2456、YTH2496、YTH3049等基因的表达,抑制了YTH2433基因的表达。上述结果表明,外源RsRHA2b基因的导入所带来的CN代谢关键酶活性的变化及对相关基因表达的影响可能是转RsRHA2b基因小麦抗穗发芽能力增强的重要原因。6.小麦TaRHA2b基因在供体基因组及不同品种上的克隆及分析利用基因组PCR技术从乌拉尔图小麦（Triticum urartu）、拟斯卑尔托山羊草（Aegilops Speltoides）、粗山羊草（Aegilops tauschii）及22个小麦品种中克隆了RHA2b基因的序列,同时对22个小麦品种做了穗发芽特性的鉴定。结果表明,小麦祖先种中RHA2b基因序列的长度变化很大,最短的441bp,最长的476bp,小麦B组供体与A/D组供体相差35bp,它们分别对应的推导的成熟多肽含143和155个氨基酸。推导的一级结构都含有Zinc finger RING-type profile。22个品种的抗穗发芽能力差异较为明显。不同品种间RHA2b基因序列的长度变化不大,但是存在许多单核甘酸多态性位点的差别。这些结果有利于开发抗穗发芽分子标记和探索RHA2b基因介导小麦抗穗发芽能力增强的原理。