前言 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的全身性疾病。其主要病理变化特点为持续性反复性关节滑膜炎，炎性细胞浸润，血管翳形成，渐进性软骨、骨组织的破坏。目前的临床治疗手段尚不能达到理想疗效。类风湿滑膜类似于局限性侵袭性生长的肿瘤，RA滑膜成纤维细胞样细胞(B型细胞)和滑膜内血管内皮细胞表达c-myc原癌基因。c-myc原癌基因的表达是细胞增殖的重要标志。c-myc原癌基因是逆转录病毒v-myc癌基因的细胞同系物，表达于多种细胞中，其编码的转录因子在控制细胞增殖、凋亡和分化过程中起重要作用，控制着几种与生长和分化相关基因转录的活化或抑制。其调节异常(如：染色体易位，DNA扩增)在多种人类肿瘤的发生、进展和早期复发中起关键性作用，因此，其成为重要的治疗靶位。 反义核酸技术是一种分子靶向性的治疗方式，它利用反义寡核苷酸在细胞内部与靶mRNA序列特异性结合，干扰其修饰或翻译过程，或通过Hoogsteen氢键结合在靶DNA上，形成局部的三螺旋结构，干扰靶基因的转录。外源性反义寡核苷酸在体内很容易被核酸酶降解，因此作为药物合成的反义寡核苷酸必须进行一定的改性，才能对核酸酶有较强的抵抗，以期在靶位点达到有效浓度，同时又不增加其毒性，目前使用最多的改性方法是对反义寡核苷酸中的磷酸二酯键进行硫代磷酸化修饰。由于反义寡核苷酸是大分子物质，细胞膜对其通透性低，因此必须在载体的帮助下，才能有效进入细胞。脂质体是人工制备的由磷脂双分子定向排列而成的类脂小体，主要成分是天然磷脂和类固醇，具有制备简单、适合生物体内降解、无毒和免疫源性，各种水溶性和脂溶性分子都可以很容易被包入脂质体，十分有利于传递反义核酸，已被美国癌症协会批准为临床基因治疗的首选载体。 已有一项细胞培养研究显示c-myc反义寡脱氧核苷酸(antisense oli-godeoxynucleotides，AS ODN)能诱导人RA滑膜B型细胞凋亡。本研究是在这一基础上进行的深入研究。目的 1.观察硫代磷酸化修饰的c一myc AS ODN在血清存在条件下对培养的RA滑膜B型细胞增殖的影响及诱导凋亡的作用;2.对c一myo mRNA两个不同位点构建c一myc AS ODN进行对照实验，观察它们对队滑膜细胞增殖的抑制作用是否不同，以期能选择出更有效的c一myc反义寡脱氧核昔酸序列;3.了解c.myc AS ODN是否对滑膜中的血管翁形成具有抑制作用，观察c一myo AS ODN对血管内皮细胞系ECV304细胞增殖的影响。通过以上研究初步明确c一myc AS ODN治疗RA的可能性。方法 自一年轻女性活动期RA患者的膝关节液分离滑膜细胞，DMEM培养 液培养，传代纯化出滑膜B型细胞;RPMI 1640培养液培养ECV 304细胞。 构建2条e一mye AS ODN序列，并构建它们的有义序列(sense oligodeoxynu- deotides，5 ODN)作为反义特异性阴性对照。针对翻译起始位点(AUG)的 c一m}rc AS ODN序列为:5‘一AAC GTT GAG GGG CAT一3‘，其5 ODN序列为5‘- ATG CCC CTC AAC GTT一3‘;针对编码区决定子(eoding region determinant， CRD)的c一myc AS ODN序列为:5‘一ATG TAT GCT GTG GCT一3’，其5 ODN 序列为5’一AGC CAC AGC ATA CAT一3‘。在对滑膜B型细胞的研究中ODN 的磷酸二醋键全部进行了硫代磷酸化修饰，而在对ECV304细胞的研究中 ODN的磷酸二醋键只在两端进行了部分硫代磷酸化修饰。ODN以阳离子 脂质体Lipofectin为载体转染细胞。用M件法对细胞的增殖进行检测，用 荧光显微镜观察Hoechst 33258染色法，流式细胞仪检测Annexin一V- FITC和PI法检测细胞凋亡的存在和变化，用流式细胞仪检测细胞内c一myc 蛋白量的变化。结果:针对翻译起始位点(AUG)的c一myo AS ODN(2 .5林moFL一10林moFL) 能显著抑制滑膜B型细胞增殖，在作用24h时此抑制作用就已发生，使细胞 数目减少的最大值为40%(2.5林moFL，48h)，相对应的。一myC 5 ODN (10协m0FL一20林moFL)对滑膜B型细胞增殖无显著影响，该c一myc AS ODN(5.0卜moFL)能下调c一myc蛋白表达，诱导滑膜B型细胞凋亡。针对CRD的e一mye AS oDN(1 .25林moFL一10林mol/L)能显著抑制滑膜B型细胞增殖，在作用至48h时此抑制作用才开始起效，使细胞数目减少的最大值为41 .4%(5林mol/L，48h)，相对应的e一哪e 5 ODN(10林mol/L)也具有显著的抑制增殖作用。2种序列的c一myc AS ODN在浓度为10林m0FL时抑制细胞增殖的作用均开始下降。 针对翻译起始位点(AUG)的e一哪e AS ODN( 2.5林moFL一5·o林moFL)能显著抑制ECV304细胞的增殖，这种抑制在。一myo AS ODN作用于细胞12h就已发生，相对应的c一myc 5 ODN(2.5林moFL)也对ECV304细胞增殖产生了相同程度的抑制作用，而5.0卜moFL。一myc 5 ODN有促进ECv304细胞增殖的作用，并且不同程度硫代磷酸化修饰的c一myo 5 ODN均有抑制或促进ECV304细胞增殖的两种作用。c一myc AS ODN和。一myc 5 ODN对ECv304细胞。一myc的表达均无明显改变。结论 硫代磷酸化的c一myc反义寡脱氧核昔酸在一定浓度