目的:本研究通过观察补肾法、疏肝法对IVF-ET胚胎着床反复失败患者治疗前后子宫内膜容受性的影响,以探讨两法对改善子宫内膜容受性,提高胚胎种植率及临床妊娠率的作用机制及异同比较。方法:将符合纳入标准及排除标准的IVF-ET胚胎着床失败患者117例设为实验组。根据中医辨证结果为肾虚证和肝郁证的不同分为补肾组和疏肝组,其中补肾组62例(增殖期35例、分泌期27例)、疏肝组55例(增殖期33例、分泌期22例)。另设因输卵管因素行IVF-ET预备周期且生殖激素及子宫内膜活检均正常者58例为对照组(增殖期32例、分泌期26例)。补肾组、疏肝组患者分别于末次移植失败后月经第5天服用补肾助孕方、逍遥丸3个月经周期,中药治疗3个周期结束后行IVF-ET常规方案或胚胎移植。补肾组、疏肝组患者于中药治疗前后增殖期(月经干净第3-5天)及分泌期(超声检测排卵后6-8天)抽取静脉血3ml,分离血清置-20℃冰箱保存备检。补肾组、疏肝组患者于中药治疗前,在其末次移植失败后行宫腔镜探查术或诊断性刮宫术(取内膜时间同取静脉血日),收集子宫内膜组织标本,中药治疗3个周期结束后,收集相对应患者增殖期或分泌期子宫内膜组织。对照组取静脉血、行宫腔镜或诊刮收集子宫内膜时间、方法同实验组。中药治疗结束后及对照组采集标本的下一周期行IVF-ET治疗或胚胎移植。所取各组新鲜内膜组织,先用生理盐水将其表面上附着的血液、粘液等清洗干净,然后将进行HE染色及免疫组织化学法的组织固定于4%多聚甲醛固定液中,将用于扫描电镜观察的组织固定于2.5%戊二醛固定液中,以上内膜组织均保存于4℃冰箱,待用;余下全部组织放入液氮中冷冻,24小时之后再将其移至-80℃冰箱内保存,用于ELISA酶联法和实时荧光定量PCR的检测。采用全自动化学发光法检测血清中E2、P的含量;采用he染色法观察子宫内膜不同分期的组织形态;采用免疫组织化学法检测子宫内膜组织中er、pr、vegf、vegfr-2、pcna、cyclind1、mmp-9、enos的蛋白表达及定位;采用扫描电镜观察种植窗期子宫内膜胞饮突;采用elisa酶联法检测子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、cyclind1、mmp-9、enos的蛋白表达;采用实时荧光定量pcr检测子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、cyclind1、mmp-9、enosmrna的表达。结果:1各组临床妊娠率及宫内妊娠率的比较补肾增殖期治疗组妊娠17例,妊娠率为48.6%,宫内妊娠率为42.9%;补肾分泌期治疗组妊娠15例,妊娠率为55.6%,宫内妊娠率为51.9%。疏肝增殖期治疗组妊娠15例,妊娠率为45.5%,宫内妊娠率为42.4%;疏肝分泌期治疗组妊娠11例,妊娠率为50.0%,宫内妊娠率为50.0%。增殖期对照组妊娠13例,妊娠率为40.6%,宫内妊娠率为37.5%;分泌期对照组妊娠10例,妊娠率为38.5%,宫内妊娠率为30.8%。与增殖期对照组和分泌期对照组比较,补肾增殖期治疗组、补肾分泌期治疗组、疏肝增殖期治疗组及疏肝分泌期治疗组临床妊娠率和宫内妊娠率均明显升高,且差异均有统计学意义(p<0.05);补肾增殖期治疗组高于疏肝增殖期治疗组临床妊娠率,且差异有统计学意义(p<0.05);补肾分泌期治疗组高于补肾增殖期治疗组及疏肝分泌期治疗组临床妊娠率和宫内妊娠率,且差异均有统计学意义(p<0.05);疏肝分泌期治疗组高于疏肝增殖期治疗组临床妊娠率和宫内妊娠率,但差异无统计学意义(p>0.05);补肾增殖期治疗组高于疏肝增殖期治疗组宫内妊娠率,但差异无统计学意义(p>0.05)。2各组血清中e2、p的含量比较与增殖期对照组、补肾增殖期治疗前组及疏肝增殖期治疗前组比较,补肾增殖期治疗后组及疏肝增殖期治疗后组血清中e2、p含量均升高,且差异无统计学意义(p>0.05);补肾增殖期治疗后组血清中e2、p含量高于疏肝增殖期治疗后组,且差异无统计学意义(p>0.05)。与增殖期对照组比较,补肾增殖期治疗前组及疏肝增殖期治疗前组血清中e2、p含量,差异均无统计学意义(p>0.05)。与分泌期对照组、补肾分泌期治疗前组及疏肝分泌期治疗前组比较,补肾分泌期治疗后组及疏肝分泌期治疗后组血清中e2、p含量均升高,且差异有统计学意义(p<0.05);补肾分泌期治疗后组血清中e2、p含量高于疏肝分泌期治疗后组,且差异有统计学意义(p<0.05)。与分泌期对照组比较,补肾分泌期治疗前组及疏肝分泌期治疗前组血清中e2、p含量,差异均无统计学意义(p>0.05)。3患者子宫内膜组织苏木精-伊红he染色结果3.1增殖期治疗前(补肾组增殖期治疗前、疏肝组增殖期治疗前)及增殖期对照组he染色结果显示:腺体组织较少,大多短小,且以椭圆形为主,偶见细长弯曲状,腺上皮低柱状,细胞核小,核分裂较少,几乎无分泌现象,间质细胞排列紧密。3.2分泌期治疗前(补肾组分泌期治疗前、疏肝组分泌期治疗前)及分泌期对照组he染色结果显示:腺体组织较多,且多成弯曲扩张状,腺上皮细胞核下空泡出现,有分泌现象,腺体内覆盖单层柱状上皮细胞,细胞核较大,色浅,间质较疏松。3.3增殖期治疗后(补肾组增殖期治疗后、疏肝组增殖期治疗后)he染色结果显示:腺体组织较多,大多数呈细长弯曲状,偶见短小者,腺上皮呈假复层,且上皮细胞有堆积倾向,细胞核分裂较多,有分泌现象,间质细胞排列较为疏松、水肿。3.4分泌期治疗后(补肾组分泌期治疗后、疏肝组分泌期治疗后)he染色结果显示:腺体组织多,且显著弯曲扩张,腺上皮细胞呈立方形,核位于中央,核大,色浅,胞浆透明,分泌现象明显,间质疏松、水肿明显。4扫描电镜观察患者子宫内膜种植窗期胞饮突结果4.1补肾分泌期治疗前组:大量微绒毛出现水肿现象,且向宫腔内突出,可见少量短小的微绒毛融合,细胞顶端出现表面光滑而细长的质膜突起(发育中的胞饮突)。4.2补肾分泌期治疗后组:几乎看不到微绒毛,可见大量表面光滑的质膜突起,大小一致,呈“花样”肿胀(充分发育的胞饮突)。4.3疏肝分泌期治疗前组:大量短小的微绒毛,相互融合,整个细胞的顶端出现光滑而细长的质膜突起(发育中的胞饮突);偶见呈鹅卵石外观的质膜突起,状似蘑菇(充分发育的胞饮突)。4.4疏肝分泌期治疗后组:微绒毛数量减少,出现大量内膜表面质膜突起,突起表面光滑,形如蘑菇(充分发育的胞饮突)。4.5分泌期对照组:质膜突起数量少,且出现皱褶现象,有的质膜突起顶端覆盖微绒毛,细胞体积增大(衰退期的胞饮突);几乎看不到“花样”肿胀的质膜突起。5各组免疫组织化学法检测患者子宫内膜组织er、pr、vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos的蛋白表达结果5.1免疫组织化学法检测患者子宫内膜组织er、pr、vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达部位er、pr在子宫内膜腔上皮、腺上皮细胞核及间质细胞核中均有表达,其中er主要在腺上皮细胞核中表达,且增殖期表达明显高于分泌期(p<0.05),而pr则主要在间质细胞核中表达,且分泌期表达显著高于增殖期(p<0.05);vegf、vegfr-2在子宫内膜腔上皮、腺上皮细胞、间质细胞及血管内皮细胞中均有表达,定位于细胞浆,其中以腺上皮细胞浆表达最为明显,表达强度自增殖期至分泌期略下降;pcna在子宫内膜腺上皮及间质细胞核内表达,且分泌期表达高于增殖期(p<0.05);mmp-9在子宫内膜的腔上皮及腺上皮细胞浆中均有表达,而在腺上皮表达高于腔上皮,间质细胞浆中也有少量表达,且分泌期表达高于增殖期(p<0.05);cyclind1主要表达于子宫内膜腺上皮的细胞核中,间质细胞核内弱表达,且分泌期高于增殖期表达(p<0.05);enos在子宫内膜腺上皮、腔上皮及血管内皮细胞浆中表达,间质细胞浆内微弱表达,且分泌期表达高于增殖期(p<0.05)。5.2免疫组织化学法检测患者子宫内膜组织er、pr、vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达结果在不同分组之间的比较与增殖期对照组、补肾增殖期治疗前组及疏肝增殖期治疗前组比较,补肾增殖期治疗后组及疏肝增殖期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达均升高,且差异均有统计学意义(p<0.05),而补肾增殖期治疗后组及疏肝增殖期治疗后组子宫内膜组织中er、pr蛋白表达均降低,且差异均有统计学意义(p<0.05);其中补肾增殖期治疗后组子宫内膜组织中pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达均高于疏肝增殖期治疗后组,且差异均有统计学意义(p<0.05),补肾增殖期治疗后组子宫内膜组织中er、pr蛋白表达均低于疏肝增殖期治疗后组,且差异均有统计学意义(p<0.05),而疏肝增殖期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2蛋白表达均高于补肾增殖期治疗后组,且差异均有无统计学意义(p>0.05);与增殖期对照组比较,补肾增殖期治疗前组和疏肝增殖期治疗前组子宫内膜组织中er、pr、vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达,差异均无统计学意义(p>0.05)。与分泌期对照组、补肾分泌期治疗前组及疏肝分泌期治疗前组比较,补肾分泌期治疗后组及疏肝分泌期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达均升高,且差异均有统计学意义(p<0.05),而补肾分泌期治疗后组及疏肝分泌期治疗后组子宫内膜组织中er、pr的蛋白表达均低于分泌期对照组、补肾分泌期治疗前组及疏肝分泌期治疗前组,且差异均有统计学意义(p<0.05);其中补肾分泌期治疗后组子宫内膜组织中pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达均高于疏肝分泌期治疗后组,且差异均有统计学意义(p<0.05),而补肾分泌期治疗后组子宫内膜组织中er、pr蛋白表达均低于疏肝分泌期治疗后组,且差异均有统计学意义(p<0.05);疏肝分泌期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2蛋白表达均高于补肾分泌期治疗后组,且差异均无统计学意义(p>0.05);与分泌期对照组比较,补肾分泌期治疗前组和疏肝分泌期治疗前组子宫内膜组织中er、pr、vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达,差异均无统计学意义(p>0.05)。6elisa酶联法检测人子宫内膜组织vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos的蛋白表达结果在不同分组之间的比较与增殖期对照组、补肾增殖期治疗前组及疏肝增殖期治疗前组比较,补肾增殖期治疗后组及疏肝增殖期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达均升高,且差异均有统计学意义(p<0.05);其中补肾增殖期治疗后组子宫内膜组织中pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达均高于疏肝增殖期治疗后组,且差异均有统计学意义(p<0.05),而疏肝增殖期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2蛋白表达均高于补肾增殖期治疗后组,且差异均有无统计学意义(p>0.05);与增殖期对照组比较,补肾增殖期治疗前组和疏肝增殖期治疗前组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达,差异均无统计学意义(p>0.05)。与分泌期对照组、补肾分泌期治疗前组及疏肝分泌期治疗前组比较,补肾分泌期治疗后组及疏肝分泌期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达均升高,且差异均有统计学意义(p<0.05);其中补肾分泌期治疗后组子宫内膜组织中pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达均高于疏肝分泌期治疗后组,且差异均有统计学意义(p<0.05);而疏肝分泌期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2蛋白表达均高于补肾分泌期治疗后组,且差异均无统计学意义(p>0.05);与分泌期对照组比较,补肾分泌期治疗前组和疏肝分泌期治疗前组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos蛋白表达,差异均无统计学意义(p>0.05)。7实时荧光定量pcr法检测子宫内膜组织vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enosmrna基因表达结果在不同分组之间的比较与增殖期对照组、补肾增殖期治疗前组及疏肝增殖期治疗前组比较,补肾增殖期治疗后组及疏肝增殖期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enosmrna基因表达均升高,且差异均有统计学意义(p<0.05);其中补肾增殖期治疗后组子宫内膜组织中pcna、mmp-9、cyclind1、enosmrna基因表达均高于疏肝增殖期治疗后组,且差异均有统计学意义(p<0.05),而疏肝增殖期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2mrna基因表达均高于补肾增殖期治疗后组,且差异均有无统计学意义(p>0.05);与增殖期对照组比较,补肾增殖期治疗前组和疏肝增殖期治疗前组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enosmrna基因表达,差异均无统计学意义(p>0.05)。与分泌期对照组、补肾分泌期治疗前组及疏肝分泌期治疗前组比较,补肾分泌期治疗后组及疏肝分泌期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enosmrna基因表达均升高,且差异均有统计学意义(p<0.05);其中补肾分泌期治疗后组子宫内膜组织中pcna、mmp-9、cyclind1、enosmrna基因表达均高于疏肝分泌期治疗后组,且差异均有统计学意义(p<0.05);而疏肝分泌期治疗后组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2mrna基因表达均高于补肾分泌期治疗后组,且差异均无统计学意义(p>0.05);与分泌期对照组比较,补肾分泌期治疗前组和疏肝分泌期治疗前组子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enosmrna基因表达,差异均无统计学意义(p>0.05)。8e2、p、er、pr、vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos之间的相关性分析e2与er、pr、vegf、enos均呈正相关(r=0.516,p=0.020;r=0.736,p=0.000;r=0.468,p=0.038;r=0.942,p=0.000);p与er、pr、vegf均呈负相关(r=-0.781,p=0.000;r=-0.837,p=0.000;r=-0.482,p=0.031);vegf与cyclind1、mmp-9、enos均呈正相关(r=0.663,p=0.001;r=0.626,p=0.003;r=0.533,p=0.016);cyclind1与pcna、mmp-9均呈正相关(r=0.931,p=0.000;r=0.878,p=0.000);mmp-9与enos呈正相关(r=0.448,p=0.048)。(p<0.05有统计学意义)结论:1补肾法、疏肝法均能显著提高ivf-et胚胎着床反复失败患者的临床妊娠率及宫内妊娠率,且补肾法高于疏肝法,分泌期优于增殖期。2补肾法、疏肝法通过提高ivf-et胚胎着床反复失败患者血清中的e2、p含量,降低子宫内膜组织中er、pr的表达,上调子宫内膜组织中vegf、vegfr-2、pcna、mmp-9、cyclind1、enos的表达,促进细胞增殖,增加子宫内膜血管生成,提高血管通透性,从而改善子宫内膜容受性,有利于胚胎着床。3补肾法、疏肝法能够改善ivf-et胚胎着床反复失败的患者子宫内膜组织形态,促进胞饮突的发育及形成,促使子宫内膜间质与腺体同步,最终使子宫内膜于“种植窗”达到最佳容受状态。4评估子宫内膜容受性主要针对于分泌期,补肾法、疏肝法于子宫内膜分泌期对子宫内膜容受性的改善优于增殖期。5补肾法在提高ivf-et胚胎着床反复失败患者血清中的e2、p含量,降低子宫内膜组织中er、pr的表达,上调子宫内膜组织中pcna、MMP-9、CyclinD1、eNOS的表达,改善子宫内膜组织形态,促进胞饮突的发育及形成,促使子宫内膜间质与腺体的同步性方面均优于疏肝法。6疏肝法上调IVF-ET胚胎着床反复失败患者子宫内膜组织中VEGF、VEGFR-2的表达高于补肾法,故疏肝法增加子宫内膜血供优于补肾法。