研究背景:口腔健康与牙齿的健康是社会文明进步的重要标志之一,也是提高生命与生活质量不可缺少的一部分。然而,我国的牙齿缺失问题相当严重,第三次全国口腔健康流行病学调查结果显示,全国65-74岁老年人有牙齿缺失者为86.1%,10%以上的老年人有全口牙缺失,严重影响口腔功能与全身健康;已有数据显示,2005年底,我国老年人口已达到1.44亿,占全国总人数的11%,到21世纪中期,老龄人口将达到30%。社会的老龄化更加突显这一问题的严重性和解决的迫切性。组织工程化牙齿被认为是未来解决这一问题最为理想的手段,也是近年来口腔医学最为活跃的研究领域之一,特别是干细胞生物学的飞速发展,成就了组织工程化牙齿研究赖以生存的基础。来源于颅神经嵴的外胚间充质干细胞（ectomesenchymal stem cells,EMSCs）是除牙釉质以外所有牙齿组织的生成细胞,被认为是上述牙源性干细胞的始祖细胞。p75NTR（p75neurotrophin receptor,神经营养因子受体）,被认为是神经嵴源性干细胞的特异性表面标志物,可用以分选神经嵴来源的外胚间充质干细胞。研究显示,p75NTR在胚胎发育过程中参与多种组织（包括神经、脂肪、肝脏、牙齿等）的形态发生和发育。尽管p75NTR在神经系统的发育过程中的重要作用已得到充分阐述,然而参与调控神经以外组织（如脂肪、肝脏、肌肉、牙齿等）形态发生的研究尚处起步阶段,特别是其在牙齿发生、发育中的潜在调控作用鲜有报道。本研究着重在p75NTR对外胚间充质干细胞矿化分化能力的影响,结合其胞内“连接伙伴”Mage-D1,NGF高亲和力膜受体Trk A及其配体NGF,阐述p75NTR对外胚间充质干细胞矿化分化能力影响的机制。为了解牙齿发生、发育机制提供理论依据,为进一步发展牙组织工程化牙齿提供实验基础。材料与方法:1.不同胚胎时期颌突外胚间充质干细胞获得、体外培养及生物学特性检测SD大鼠胚胎12.5天外胚间充质干细胞组（E12.5d EMSCs）;SD大鼠胚胎19.5天外胚间充质干细胞组（E19.5d EMSCs）体外培养与生物学特性检测:SD大鼠胚胎12.5天外胚间充质干细胞组（E12.5d EMSCs）:选择SD大鼠从见阴栓午间为胚胎0.5d,第12天午间以40mg/kg注射2%戊巴比妥钠,行腹腔手术,取出3-5个胚胎后,分层缝合,待孕鼠苏醒后标记好继续饲养。取出的胚胎切取颌突组织,PBS缓冲液冲洗,眼科剪尽量剪碎组织,1%Ⅰ型胶原酶消化,中和离心,去上清后将组织均匀平铺于6cm培养皿中,加入含100ml/L胎牛血清的DMEM-F12培养液约4-5ml,置于含5%CO₂的恒温箱中培养,37℃。SD大鼠胚胎19.5天颌突外胚间充质干细胞组（E19.5d EMSCs）:以E12.5d手术后孕鼠继续饲养胚胎第19.5天,第19.5天午间以40mg/kg注射戊巴比妥钠,行腹腔手术,取出3-5个胚胎。取出的胚胎分离上下颌,显微镜下用眼科镊取出牙胚组织,1%Ⅰ型胶原酶消化,中和离心1000r/min,3min,去上清后将组织均匀平铺于6cm培养皿中,加入含100ml/L胎牛血清的DMEM-F12培养液约4-5ml,置于含5%CO₂的恒温箱中培养,37℃。分别从细胞形态学、细胞增殖、流式细胞检测表面分子等方面对两种EMSCs进行检测、鉴定。2.P75NTR及相关矿化基因Runx2在颌突及牙胚中时空表达的检测免疫组织化学方法检测p75NTR及相关矿化基因Runx2在大鼠胚胎颌突及牙胚中的时空表达。分别于胚胎E12.5d及E19.5d取大鼠胚胎头部,4%多聚甲醛固定24h,以6um厚度冠状切片方向作冰冻切片,p75NTR及Runx2相应一抗作常规免疫组化染色。3.对比不同时期颌突外胚间充质干细胞矿化能力差别体外矿化诱导E12.5d及E19.5d颌突外胚间充质干细胞,对比两者矿化能力区别。利用矿化诱导液（以50 g/L抗坏血酸、10 mmol/Lβ甘油磷酸钠、10-8M地塞米松及100ml/L胎牛血清配制α-MEM矿化诱导液）每3天换液1次。矿化诱导第7天收集RNA,逆转录为c DNA后进行Real Time-PCR检测相关基因表达趋势及ALP染色,诱导第14天进行收集蛋白进行western blot检测相关蛋白趋势,第28天进行茜素红染色,观察矿化结节形成情况。4.外胚间充质干细胞矿化诱导过程中p75NTR及相关基因表达检测体外矿化诱导E19.5d颌突外胚间充质干细胞,分别在矿化诱导的3天,7天,14天,21天提取细胞RNA,收集蛋白及细胞培养基。利用Real Time-PCR,western blot及IP检测相关基因蛋白水平及p75NTR与Mage-D1结合表达的变化,ELISA法分析细胞培养基中NGF在不同诱导时期的细胞分泌量变化,免疫共沉淀检测p75NTR与Mage-D1在矿化诱导过程中蛋白之间相结合的变化趋势。5.P75NTR调控外胚间充质干细胞矿化能力的检测利用p75NTR过表达质粒pLJM1-P75包装入慢病毒,感染E19.5d颌突外胚间充质干细胞,上调p75NTR在目的细胞中表达;利用p75NTRsiRNA转染E19.5d颌突外胚间充质干细胞,下调p75NTR在目的细胞中表达,实验分为4组:p75siRNA（转染p75NTRsiRNA组）、NCon（阴性对照组）、pLJM1-P75（p75NTR过表达质粒pLJM1慢病毒感染组）、pLJM1（空载体组）。在矿化诱导第7天提取各组RNA进行Real Time-PCR检测相关基因表达变化及ALP染色,矿化诱导第14天收集各组蛋白进行Western blot检测相关蛋白表达变化,矿化诱导第28天进行各组茜素红染色,观察矿化结节形成情况。利用CCK-8试剂盒检测pLJM1-P75与pLJM1组外胚间充质干细胞增殖能力的变化。6.Mage-D1及NGF对颌突外胚间充质干细胞矿化能力的影响利用Mage-D1siRNA转染E19.5d颌突外胚间充质干细胞,下调Mage-D1在目的细胞中的表达;利用100ng/ml NGF作为p75NTR上游配体及激活剂,处理目的细胞,上调p75NTR表达,实验分为3组:NCon（阴性对照组）、Mage-D1siRNA（转染Mage-D1siRNA组）、NGF（100ng/ml NGF处理组）。在矿化诱导第7天提取各组RNA进行Real Time-PCR检测相关基因表达变化及ALP染色,矿化诱导第14天收集各组蛋白进行Western blot剂IP检测相关蛋白表达及p75NTR与Mage-D1结合表达变化。7.实验动物模型的制作培养、鉴定及P75NTR基因敲除小鼠Micro CT扫描P75NTR基因敲除（p75NTR-/-）小鼠,P75NTR杂合子小鼠（p75NTR+/-）及野生型小鼠背景均为129/sv（均源于美国Jackson实验室）,将p75NTR-/-小鼠、p75NTR+/-小鼠及野生型交配,成功交配生产繁殖后,于出生后第10天剪去小鼠尾巴2mm,做好标记,提取DNA,利用QIAGEN Master Mix试剂盒进行基因型鉴定。同一天生产的同窝P75NTR基因敲除（p75NTR-/-）小鼠,P75NTR杂合子小鼠（p75NTR+/-）及野生型小鼠,常规饲养至60天。随机挑选性别,以50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,脱颈处死。分离干净股骨,置入4%多聚甲醛固定组织,于Micro CT（viva ct40 Scanco Medical AG;Brüttisellen,Switzerland）进行扫描,后利用其配套软件进行图形规划数据分析整理。结果:1.E12.5d EMSCs和E19.5d EMSCs分别从相应时期胚胎中颌突组织和牙胚组织中获取,E19.5d EMSCs在显微镜下观察,较E12.5d EMSCs细胞形态更显规则的纺锤状成纤维细胞形态。E12.5d EMSCs形成克隆集落及数目大小相较E19.5d EMSCs多及大。利用CCK-8试剂盒检测两者增殖能力的区别,E12.5d EMSCs增值能力较E19.5d EMSCs为高。流式细胞仪表面分子检测两种细胞相应表面分子表达,E12.5d EMSCs:CD14（90.4%）,CD29（79.5%）,CD44（92.8%）,CD90（99.03%）,CD105（29.3%）,CD146（98.1%）和CD166（99.45%）;E19.5d EMSCs:CD14（90.46%）,CD29（98.93%）,CD44（98.26%）,CD90（99.64%）,CD105（25.97%）,CD146（97.39%）和CD166（97.22%）。两种细胞都阴性表达CD45,分别为:3.34%和2.08%。而神经嵴源性标志性表面分子p75NTR,E19.5d EMSCs的表达为92.89%,较E12.5d EMSCs表达23.1%显著性得增高。2.在牙发育起始期（E12.5d）,p75NTR在增厚的口腔上皮中未见表达,但是在相对应的邻近间充质（浓聚间充质）中存在弱表达,且能在未来牙源性上皮间充质相互反应区域的间充质细胞中见表达。在牙发育钟状期（E19.5d）,p75NTR在内釉上皮,牙囊,牙乳头接近上皮区域强表达,这些区域在牙发育后期会出现矿化作用。Runx2表达与p75NTR表达存在重叠区域。3.矿化诱导7天,E19.5d EMSCs的ALP染色深度高于E12.5d EMSCs。矿化诱导28天,茜素红染色显示,E19.5d EMSCs矿化结节形成的大小及数目相较于E12.5d EMSCs都为大及多。Real Time-PCR显示,E19.5d EMSCs p75NTR表达显著高于E12.5d EMSCs。对比两者矿化能力大小,矿化相关基因Runx2、ALP、Osteorix及Col1同源盒基因Dlx5和Msx2都与矿化及成牙相关,E19.5d EMSCs表达都高于E12.5d EMSCs。western blot和Real Time-PCR结果显示Mage-D1在两种细胞中的表达未见明显差异。并且两者都未见Trk A的表达。4.矿化诱导过程中,western blot和Real Time-PCR结果显示,E19.5d EMSCs的p75NTR表达随矿化诱导天数增加而不断增加。矿化相关基因Runx2、ALP、Osteorix及Col1同源盒基因Dlx5和Msx2与p75NTR趋势相同,Trk A未在矿化过程中存在表达。虽然Mage-D1表达在矿化过程中未见明显变化,但是免疫共沉淀结果显示,Mage-D1与p75NTR的结合强度随矿化诱导天数增加而不断增加。ELISA结果显示自分泌NGF分泌量随矿化诱导天数增加而不断增加,矿化诱导3天时为31.3±4.4 pg/ml,诱导21天后为378.3±10.9 pg/m。5.pLJM1-p75 EMSCs组p75NTR免疫荧光染色最深,Mage-D1的免疫荧光染色在四个实验组中未见明显差异。利用pLJM1质粒过表达p75NTR,慢病毒转染入E19.5d EMSCs,矿化相关基因Runx2、ALP、Osteorix及Col1同源盒基因Dlx5和Msx2表达随p75NTR过表达而增加。然而,利用P75NTR siRNA转染细胞,E19.5d EMSCs矿化相关基因也随着降低。ALP染色在pLJM1-p75 EMSCs组染色最深,而在p75siRNA EMSCs组染色最浅。茜素红染色矿化结节也显示,pLJM1-p75 EMSCs组矿化结节形成量多及形成较大。形态学显示pLJM1-p75 EMSCs组细胞的形态为更为规则的长梭形成纤维样细胞。但是pLJM1-p75 EMSCs组的细胞增殖能力较pLJM1 EMSCs组为弱。6.Mage-D1 siRNA组EMSCs ALP染色为最浅。相比较的是100ng/ml NGF组ALP染色为最深。与三组细胞ALP染色的趋势相一致,western blot和Real Time-PCR结果显示矿化及成牙相关基因Runx2,Col1,同源盒基因Dlx5和Msx2表达量在Mage-D1 siRNA组为低,而在100ng/ml NGF组较高。但是Mage-D1在100ng/ml NGF处理组未见表达变化。而免疫共沉淀结果显示,Mage-D1与p75NTR结合在100ng/ml NGF处理组较高,而在Mage-D1 siRNA组较低。所有实验组中的EMSCs都是用的同一代EMSCs以及相同状态的EMSCs展开研究。7.P75NTR敲除小鼠基因型鉴定结果,单独呈现280bp条带为p75NTR敲除小鼠纯合子型,单独呈现345bp条带为野生型小鼠,而两条带都存在于同一泳道为p75NTR杂合型小鼠。Micro CT扫描60天同批次同窝小鼠股骨,三组小鼠（P75NTR基因敲除（p75NTR-/-）小鼠,P75NTR杂合子小鼠（p75NTR+/-）及野生型小鼠）扫描后三维重建数据分析结果:骨小梁骨的分析中TRI-BV（骨量）,TRI-BV/TV（骨体积分数）,TRI-Tb.N（骨小梁数）,TRI-Tb.Th（骨小梁厚度）,p75NTR-/-小鼠较p75NTR+/-及野生型小鼠为低,而TRI-BS/BV（骨表面积/骨量）,TRI-Tb.Sp（骨小梁分离度）,在p75NTR-/-小鼠中高于其他两组小鼠,同段股骨的骨皮质骨的分析中:骨皮质厚度TRI-C.TBTh以及骨皮质骨量TRI-C.BVp75NTR-/-小鼠较p75NTR+/-及野生型小鼠为低,但TRI-C.BS/BV在p75NTR-/-小鼠中高于其他两组小鼠。结论:1.成功体外培养获得高纯度E12.5d颌突来源外胚间充质干细胞及E19.5d牙胚来源外胚间充质干细胞,两种细胞经鉴定都为间充质来源细胞,且E12.5d颌突外胚间充质干细胞增殖能力高于E19.5d牙胚外胚间充质干细胞。但P75NTR表达及矿化能力E19.5d牙胚外胚间充质干细胞高于E12.5d颌突外胚间充质干细胞,且p75NTR与Runx2在牙发育各时期表达区域重叠,表明p75NTR在颌突及牙育前期与其矿化发育相关。2.p75NTR在外胚间充质干细胞矿化过程中表达随矿化时间不断增加,表明p75NTR介导外胚间充质干细胞矿化过程。3.在外胚间充质干细胞中过表达及干扰p75NTR表达,其矿化能力随趋势而变化,表明P75NTR正向调控外胚间充质干细胞矿化能力。4.P75NTR通过结合Mage-D1,影响矿化及成牙相关基因与同源盒基因表达,进而影响外胚间充质干细胞矿化能力的变化。5.P75NTR基因敲除小鼠,Micro CT扫描结果表明,p75NTR敲除导致骨发育不良。综上所述及本研究结果表明,P75参与胚胎颌面部及牙发育,且EMSC矿化作用可能由P75NTR与细胞内Mage D1相结合,进而影响成牙及矿化相关转录因表达变化,最终影响EMSC矿化能力,初步阐述颌面部发育期P75NTR参与的EMSC矿化机制,为颌面部发育及牙发育过程中细胞分化机制,牙发育组织工程提供理论基础及实验依据。