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背景吗啡是一种临床常用的强阿片类镇痛药,已知其对患者免疫功能有一定干预作用。我们前期研究发现,吗啡刺激Th(T helper lymphocyte,T辅助淋巴细胞)细胞后,胞内细胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α以及IFN-y均分泌减少,同时导致Thl/Th2比值失衡,其机制不详。PI3K/AKT (Phosphatidylinositol3-Kinase/Protein Kinase B,磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B)信号通路参加适应性免疫反应包括Th细胞增殖和细胞因子分泌等。PKCθ(Protein Kinase C θ,蛋白激酶Cθ亚基)信号通路调控AP-1, NF-κB、NFAT等转录因子的表达,参与Th细胞的分化与增殖过程。因此,我们推测吗啡可抑制Th细胞分化,其机制可能与PI3K/AKT或PKCθ信号通路有关。本研究拟验证此假说。第一部分Th细胞提取目的提取纯度>95%、凋亡率<5%的Th细胞,为后期实验提供细胞。方法取20名健康志愿者外周静脉血20毫升,采用密度梯度离心法分离PBMC(Peripheral blood mononuclear cell,外周血单个核细胞),MACS (Methods Madnetic activated cell sorting,免疫磁珠分离法)提取纯Th细胞,采用流式细胞分析仪检测细胞纯度及凋亡度。结果分离Th细胞纯度达到95%,细胞凋亡率控制在5%以下。结论采用免疫磁珠分离的Th细胞可以达到本实验所要求的细胞纯度与凋亡度。第二部分吗啡对Th细胞分化及PI3K/AKT和PKCθ信号通路的影响目的探讨吗啡对Th细胞分化及PI3K/AKT和PKCθ信号通路的影响。方法将备用的Th细胞随机分组,空白对照组(C组)；PMA(佛波酯)+Ion(离子霉素)组(PI组)；PMA+Ion+吗啡25ng/ml(M1组)；PMA+Ion+吗啡50ng/ml(M2组)；PMA+Ion+吗啡100ng/ml(M3组)；PMA+Ion+吗啡200ng/ml(M4组)；吗啡200ng/ml(MO组)；放入含10%FBS RMPI1640培养基,在37℃C、5%C02恒温细胞孵育箱中孵育4小时。采用流式细胞分析术检测各组胞内细胞因子IFN-γ、^IL-4水平及Western blotting法检测各组AKT, PKC9磷酸化表达情况。组间比较采用ANOVA (one-way Analysis of Variance,单因素方差分析)检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果与C组比较：M1、M2、M3、M4组胞内IFN-γIL-4水平和IFN-y/IL-4比值均明显增加(P<0.05)；MO组上述细胞因子水平与IFN-y/IL-4比值无明显变化(P>0.05)。与PI组比较：M2、M3、M4、MO组胞内IFN-y水平和IFN-y/IL-4比值降低(P<0.05)；M1组的胞内IFN-y水平和IFN-y/IL-4比值变化无明显差异(P>0.05); Ml、M2、M3、 M4组的胞内IL-4水平变化无明显差异(P>0.05)；C组、MO组的胞内IL-4水平均明显降低(P<0.05)。与C组比较：PI、M2组的p-AKT蛋白表达量明显增加(P<0.05)；M1组、M3组、M4组、MO组的p-AKT蛋白表达量无明显差异(P>0.05); PI、M1、M2、M3、M4组的p-PKCθ蛋白表达量明显增加(P<0.05)；MO组的p-AKT、 p-PKCθ蛋白表达量无明显差异(P>0.05)。与PI组比较：M1、M2、M3、M4组的p-AKT蛋白表达量明显降低(P<0.05)；MO组的p-AKT蛋白表达量无明显差异(P>0.05)；M1组、M2组、M3组、M4组的p-PKCθ蛋白表达量无明显差异(P>0.05)；MO组的p-PKCθ蛋白明显降低(P<0.05)。结论本实验中吗啡抑制Th细胞向Thl分化的部分机制可能与PI3K/AKT信号通路有关,与PKCθ信号通路无关。第三部分纳诺酮对吗啡抑制Th细胞分化作用的拮抗效应目的探讨第二部分吗啡对Th细胞分化的抑制作用及PI3K/AKT信号通路是否可被纳诺酮拮抗。方法将备用的Th细胞随机分组,空白对照组(C组)；PMA+Ion组(PI组)；PMA+Ion+吗啡50ng/ml(M组)；PMA+Ion+吗啡50ng/ml+纳诺酮25ng/ml(N1组)；PMA+Ion+吗啡50ng/ml+纳诺酮50ng/ml(N2组)；纳诺酮50ng/ml(NO组)。放入含10%FBS RMPI1640培养基,在37℃5%CO2恒温细胞孵育箱中孵育4小时。采用流式细胞分析术检测各组胞内细胞因子IFN-γ、IL-4水平及Western Blotting法检测AKT蛋白表达情况。组间比较采用ANOVA (one-way|Analysis of Variance,单因素方差分析)检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果与C组比较：PI、M、N1、N2组的胞内IFN-γ、IL-4水平和IFN-γ/IL-4比值明显增加(P<0.05)；NO组的上述细胞因子与IFN-y/IL-4比值比较无明显变化(P>0.05)。与M组比较：N1、N2组的胞内IFN-y水平和IFN-y/IL-4比值升高(P<0.05)；NO组的胞内IFN-y水平下降和IFN-y/IL-4比值明显降低(P<0.05)；N1组、N2组的胞内IL-4水平无明显变化(P>0.05)；NO组的胞内IL-4水平明显降低(P<0.05)。与C组比较：PI、M组、N1组、N2组的p-AKT蛋白表达量明显增加(P<0.05)；NO组的p-AKT蛋白表达量无明显改变(P>0.05)。与M组比较：N1组的p-AKT蛋白表达量无明显差异性(P>0.05)；N2组的p-AKT蛋白表达量升高(P<0.01)；NO组的p-AKT蛋白表达量降低(P<0.05)。结论纳诺酮通过μ受体拮抗吗啡对Th细胞的调节作用,其受体后部分机制与PI3K/AKT信号通路有关。