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肝素具有抗凝血、抗炎症、抗肿瘤等多种医学功能,应用广泛、需求量大。在肝素的各种制备方法中,目前动物源肝素仍占主导地位,但是多起肝素污染事件的发生,使研究者将目光转向了更加安全可控的微生物源肝素制备。Escherichia coli K5荚膜多糖中含有一种成分叫肝素前体(heparosan),结构类似于未硫酸化肝素,可作为肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前体。本研究从培养基的优化、补料方法的研究和产物heparosan分离纯化及其分子量的分布等方面对E. coli K5发酵产heparosan进行了研究,为规模化肝素制备奠定基础。首先对培养条件和培养基进行了优化,确定接种量为3%,装液量为18%,起始pH为7.0～7.5；10g/L甘油+10g/L葡萄糖为起始碳源,4g/L(NH4)2HPO4为无机氮源；对CoCl2、LaCl3、LiCl、SnCl2进行单因素试验,结果发现0.01g/L SnCl2;对E. coli K5产heparosan有促进作用；通过对MgSO4·7H2O、柠檬酸、KH2PO4、微量元素四个因素进行了L9(34)正交试验,确定了最优配比：MgSO4·7H2O0.7g/L,柠檬酸0.8g/L；KH2PO413.5g/L,微量元素溶液5mL/L。同时对E. coli K5发酵产heparosan补料流加方式进行了研究。选出了E. coli K5上罐发酵的最佳种子培养基为葡萄糖合成培养基,最佳种子培养时间为6h；对恒速补料、葡萄糖反馈补料、拟指数补料方式进行了比较研究,得出了E. coli K5在拟指数流加补料的方式下生长最优,细胞生物量和heparosan的产量分别达到5.7gDCW/L和1.2g/L,比批次发酵分别提高了200%和700%。考察了上样量和上样流速对DEAE琼脂糖树脂纯化heparosan粗多糖的影响,当柱体积为40mL树脂时,确定了较优粗多糖上样量和上样流速分别为0.4g粗多糖和2.5mL/min,洗脱液体积为4倍柱体积(160mL)。对发酵液中heparosan多糖直接进行PAGE分析,发现发酵液中heparosan分子量的分布范围较广。