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研究背景:有很多研究报道5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-aminolevulinic acid photodynamic therapy,ALA-PDT)可有效对抗各种癌症。然而,目前越来越多研究表明ALA-PDT可同样有效治疗人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染相关疾病如生殖器尖锐湿疣和宫颈上皮内瘤变。有证据表明,细胞自噬和凋亡在PDT治疗中发挥重要作用,但其潜在机制尚未明确。研究目的:1.探索ALA-PDT治疗尖锐湿疣过程中,对HPV病毒载量的影响。2.体外设计ALA-PDT实验,以HeLa细胞为研究对象,探索ALA-PDT治疗尖锐湿疣和降低病毒载量的具体机制,分析自噬与凋亡的作用及可能介导的信号通路。3.探索自噬降解抑制剂羟氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)与ALA-PDT联合使用时,影响自噬和细胞增殖的具体机制。研究方法:1.ALA-PDT疗法治疗尖锐湿疣临床疗效观察在本项研究中,我们首先纳入了111例尖锐湿疣患者,并对每位患者进ALA-PDT治疗。以病毒载量变化作为判断疗效的主要指标。结果发现,治疗前后HPV载量存在显著差异。1.1 ALA-PDT对尖锐湿疣患者治疗前后病毒载量变化影响对每位患者进行ALA-PDT治疗时,动态检测HPV型载量变化。统计分析患者治疗前、治疗3次与6次后病毒载量变化情况。1.2 ALA-PDT对高危型和低危型HPV载量的影响对HPV型别进行分组:高危型与低危型,分别统计各亚组内ALA-PDT治疗前、治疗3次与6次后病毒载量变化情况,分析ALA-PDT对不同型别HPV感染的治疗效果。1.3 ALA-PDT对宫颈尖锐湿疣患者HPV载量的影响以宫颈尖锐湿疣为例,进一步分析ALA-PDT治疗特殊部位尖锐湿疣效果。同时,对临床扩展ALA-PDT适用范围、治疗高危型HPV感染及癌前病变提供理论依据。2.ALA-PDT通过诱导自噬与凋亡抑制HeLa细胞增殖的机制研究为了进一步探索ALA-PDT降低病毒载量的机制,我们利用体外实验,用ALA-PDT处理HeLa(HPV18)细胞,通过Western Blot、荧光、流式等方法检测自噬与凋亡相关指标变化情况,并探讨光动力治疗过程中自噬和凋亡的作用和可能的通路。3.自噬降解抑制剂HCQ对ALA-PDT细胞杀伤效应的影响首先,使用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法,测定加入 HCQ 后,在 3 h,6 h,12 h和24 h不同时间点下细胞增殖率变化。根据所测得不同时间的增殖率,选定一个时间点进行后续研究。分别通过流式测定活性氧水平以及荧光显微镜下观察不同组间自噬流的形成。Western Blot进一步分析HCQ对Ras/Raf/MEK/ERK 和 PI3K/AKT 通路的影响。研究结果:1.ALA-PDT可显著降低尖锐湿疣患者治疗前后病毒载量ALA-PDT可显著降低尖锐湿疣患者HPV病毒载量,对于高危、低危型HPV感染均有显著治疗效果。此外,对于宫颈尖锐湿疣患者,ALA-PDT同样可有效降低病毒载量,达到治愈效果。ALA-PDT的这种效应,能有效治疗尖锐湿疣并降低复发率。对于进一步指导PDT用于高危型HPV感染所致癌前病变、癌变具有重要意义。2.ALA-PDT通过促进自噬与凋亡来抑制HeLa细胞增殖ALA-PDT对HeLa细胞抑制效应呈剂量和时间依赖性。自噬相关蛋白检测显示,ALA-PDT显著促进LC3Ⅱ和p62的表达上调。同时,ALA-PDT可促进caspase-3 和 cleaved caspase-3 的表达。Western blot 显示,ALA-PDT 能显著上调Ras/Raf/MEK/ERK通路和下调PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化水平。通过调控上述通路,诱导自噬的产生,从而达到对HeLa细胞杀伤的效果,有效降低细胞的增殖。3.HCQ对ALA-PDT细胞杀伤效应的影响HCQ显著增强ALA-PDT细胞杀伤效应。CCK-8实验表明,加入HCQ后,在不同时间点,ALA-PDT+HCQ对细胞的抑制作用均显著增强。通过流式与ROS抑制实验发现,HCQ通过上调细胞内ROS水平,起到促进光动力细胞杀伤的效果。Western Blot进一步显示,经ALA-PDT-HCQ处理后,细胞内自噬相关基因Beclin-1表达增加,自噬通路PI3K和AKT的磷酸化水平进一步降低,而ERK的磷酸化水平无明显变化。研究结论:本文研究证实,ALA-PDT能显著降低尖锐湿疣患者HPV病毒载量,对高危型、低危型HPV感染和宫颈尖锐湿疣患者均有明显的治疗效果。对HPV载量的变化监测,有助于判断光动力的疗效和指导光动力治疗。体外实验表明,ALA-PDT在临床治疗过程中,应存在最佳剂量效应,而这种剂量的选择与确定需要进一步研究和探讨。ALA-PDT通过激活Ras/Raf/MEK/ERK通路和抑制PI3K/AKT通路,诱导HeLa细胞的自噬。另外,ALA-PDT可同时促进细胞凋亡;通过抑制细胞增殖和下调HPV E6/E7蛋白表达来降低病毒载量。自噬降解抑制剂HCQ在与ALA-PDT联合使用时,能够显著上调HeLa细胞内ROS含量,通过进一步抑制PI3K/AKT通路,促进自噬相关基因Beclin-1表达,从而增强ALA-PDT诱导自噬和杀伤细胞的效果。以上结论除证实ALA-PDT对治疗尖锐湿疣有效性以外,为我们探索增强临床ALA-PDT效果、扩展ALA-PDT治疗范围、减少治疗抵抗提供了新的思路。