简介心血管疾病疾病仍然是全球范围内导致人类死亡的主要原因。尽管溶栓、急诊冠脉介入及冠脉搭桥开通“罪犯”血管明显减少了急性心肌梗死（AMI）死亡率，但临床上一直无法避免心肌缺血/再灌注损伤（IRI）带来的并发症，如心力衰竭、恶性心律失常。尤其是在合并糖尿病的情况下，AMI住院死亡率是非DM者的2-4倍。如何减轻心肌IRI，一直是心脏病医生及科研工作者面临的严峻挑战。1993年Przyklenk提出的远端缺血适应的概念，他研究发现反复短暂阻塞（缺血5min/再灌注5min,共4个循环）狗的冠脉回旋支后，可减轻前降支阻断导致的致命缺血。而且在临床上部分研究也证明了缺血性适应这一策略的有效性。但是远端缺血后适应（RIPostC）的心脏保护机制并不十分明确，尤其在并发DM等危险因素时，疗效一直存在争议。最近10年，细胞自噬调控治疗引起了科学家极大关注。自噬是在基础及病理状态下一个受基因严格调控的细胞内容物降解和再循环的过程，参与了蛋白质、细胞器的代谢和再利用以及对细胞内生物能量的补充，主要表现为细胞质中出现大量包裹着蛋白质和细胞器的空泡结构（自吞噬小泡）。目前很多研究发现自噬的激活在心肌IRI中起着重要作用，但自噬对心脏的保护作用目前仍有争论。MicroRNAs（miRNAs）是大约19-25个核酸组成的单链RNA，涉及到转录后基因沉默，它通过保守的6-8bp种子序列影响大约30%人类基因蛋白编码，因此miRNAs在正常生理、病理状态，包括癌症及心血管疾病中起重要作用。很多研究已经证明miRNAs涉及到动脉粥样硬化、心肌梗死及心力衰竭。尽管许多研究已发现在应激状态下许多miRNAs能调控自噬，并且有研究发现miRNA能减轻心肌IRI，但与RIPostC相关的miRNA是否涉及自噬通路调控，减轻心肌IRI，目前国内尚无人研究。已有研究证明miRNA可以调控细胞自噬，并且,因此我们重点研究：（1）在合并DM或不合并DM的小鼠, RIPostC能否减轻IRI，对心脏具有保护作用？（2）如果是，RIPostC诱导的这种心脏保护作用是否涉及自噬调控？（3） RIPostC联合Metformin是否通过诱导自吞噬减轻DM小鼠IRI？（4） RIPostC是否诱导心肌IRI模型miRNA的变化?（5）与RIPostC心脏功能保护相关的miR-27a是否保护心肌细胞低氧/复氧损伤？方法学首先我们应用C57BL/6正常小鼠及STZ诱导（150mg/kg,一次性腹腔注射）的DM小鼠心肌IRI模型（缺血30min/再灌注1-3h），分别给予远端缺血后适应(RIPostC)（左后肢接受3个循环5-min闭塞，5-min再灌注）处理，在非糖尿病（ND）及糖尿病（DM）组内，分别分为四组：假手术组，IR组，IR+RIPostC组，及IR+RIPostC+3MA组。采用心脏超声评估左室射血分数，通过Evans blue及TTC染色计算心肌梗死面积。应用免疫组化、western blot（包括Beclin-1,LC3及p62）及透射电镜（TEM）检测心肌细胞的自噬程度。针对STZ诱导DM心肌IRI模型，我们进一步分为四组：假手术组，IR组，二甲双胍组（Met）组及RIPostC+Met联合处理组，观察疗效单一Met治疗及RIPostC+Met联合治疗对IRI疗效。运用上述同样方法评估梗死面积及心脏功能，应用肌钙蛋白T ELISA试剂盒测定血清TnT含量，利用Tunel及wester blot检测细胞的凋亡，细胞自噬应用上述三方面方法来评估。为了探索RIPostC+Met联合治疗对DM-IRI自噬调控机制，我们又进一步应用自噬抑制剂（渥曼青霉素）及AMPK通路抑制剂（复合物C）观察对心脏功能及自噬通路的影响。在miRNA研究中，我们首先应用正常小鼠IRI经RIPostC成功干预心脏模型，然后应用miRNAs芯片筛选出与RIPostC相关的miRNAs。再用real-time PCR验证miRNAs芯片结果，得到与RIPostC相关的目标miRNA。最后我们将miR-27a前体及其抑制剂分别导入H9C2心肌细胞，观察心肌细胞在低氧/复氧刺激（HR）下，应用CCK-8、ELISA评估研究miR-27a对心肌细胞功能的作用，应用细胞流式及western评估凋亡指标，通过细胞免疫荧光、western及透射电镜研究自噬调控规律；为了深入研究miR-27a调控自噬机制，我们用慢病毒包装的高表达miR-27a质粒及SMAD5质粒转染H9C2。然后利用双荧光素酶报告基因验证了miR-27a的靶基因。最后应用wester blot探索了miR-27a调控细胞自噬的Akt-mTOR通路。结果1.在非DM及DM小鼠,心肌IRI激活了心肌细胞自噬。在非DM小鼠，与IR相比RIPostC导致心肌梗死面积减小(32.6±3.0%vs50.6±2.4%, P<0.05vs ND-IR)，心脏射血分数增加(49.70±3.46%vs31.30±3.95%, P<0.05)。然而RIPostC却不能保护DM小鼠心脏功能（RIPostC vs IR, IS/AAR及EF,P>0.05）。与IR相比，Western blot及免疫组化分析：在正常小鼠RIPostC上调了自噬标记Beclin-1及LC3-II/LC3-I，下调了p62表达，TEM显示RIPostC增加了自噬小体的数量；但在DM小鼠，RIPostC却不能诱导Beclin-1、 LC3-II/LC3-I，及p62的改变，自噬体的数量也无明显差异。进一步研究分析分析DM小鼠基线磷酸化AMPK水平低于非DM小鼠。2.对STZ诱导的DM小鼠IRI模型，与IR对照组（54.93±6.46%）比较, RIPostC+Met组（24.69±4.10%）及Met治疗组（36.7±4.6%）明显减小了梗死面积(两者P<0.05)；与单一Met治疗比较，RIPostC+Met治疗进一步减少了梗死面积(24.69±6.02%vs.36.7±4.6%, P>0.05)。对心功能的影响，心脏超声显示：RIPostC+Met组LVEF明显高于Met单独治疗组(56.7±6.1%vs.45.7±5.8%, p <0.05)。并且心肌梗死标记物肌钙蛋白T(Troponin T, TnT)在RIPostC+Met组与Met单独治疗组之间有明显差异(P <0.05)。尽管Met单独治疗与IR对照组相比，增加了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率及Beclin-1表达（P<0.05），但RIPostC联合Met治疗比自噬的程度更高（P<0.05）；与Met单独治疗相比，RIPostC联合Met治疗增加了Bcl-2表达，减少了Caspase3水平，(P<0.05),减少了凋亡百分数(P<0.05)。Wort(15μg/kg)及CC(20mg/kg)预处理则完全逆转了RIPostC+Met及Met治疗的心脏保护，抵消了两种治疗对心肌自噬的诱导。3.在正常小鼠IRI模型，RIPostC刺激后，miRNA芯片筛选出103个上调或下调的miRNA，经real-time PRC验证发现：RIPostC诱导了miR-27a及miR-20a上调。4.在不同HR时间点，HR刺激诱导了H9C2心肌细胞miR-27a及自噬的变化，在低氧12h/复氧4h LC3及miR-27a表达达峰值。与对照组相比，pre-miR-27a(50nM)增加了细胞活力，降低了LDH,抑制了细胞凋亡；相反，miR-27a抑制剂却减少了细胞活力，增加了LDH，抑制了凋亡。Western blot分析：与对照组相比，pre-miR-27a增加了LC3-II/LC3-I比率，下调了p62表达；miR-27a抑制剂减少了LC3-II/LC3-I比率，上调了p62表达。LC3免疫荧光结果与Western blot一致。TEM也发现pre-miR-27a增加了自噬体的数量，而miR-27a抑制剂却减少了自噬体的数量；荧光素酶双报告基因验证了SMAD5是miR-27a的一个靶基因。在慢病毒转染高表达miR-27a的H9C2细胞系中，导入SMAD5质粒（高表达）后，发现，CCK-8减少，LDH增加，自噬水平下调。与对照组相比，Western显示pre-miR-27a下调了p-Akt2及p-mTOR水平；相反，miR-27a抑制剂却上调了p-Akt2及p-mTOR水平。结论1.在正常小鼠，而非糖尿病小鼠RIPostC可能部分通过诱导心肌细胞自噬减轻IRI；2. RIPostC联合Met诱导DM心肌自噬，抑制了心肌细胞凋亡，减轻了DM小鼠IRI,且疗效优于单一Met治疗；3. MiR-27a及miR-20a可能是与RIPostC心脏保护相关的miRNA。4.与RIPostC有关的miR27a通过SMAD-Akt-mTOR通路诱导了自噬，抑制了细胞凋亡，减轻心肌细胞HR损伤，保护细胞功能。