论文部分内容阅读
群体感应及其淬灭作用是近年来在微生态领域最为重要的发现之一。微生物间通过群体感应与淬灭作用建立细胞-细胞间的通讯连接,并在微生物间生态竞争与动态平衡中发挥重要作用。目前群体感应淬灭已经成为抗细菌感染研究的热点领域。然而生物体是一个整体系统,微生物与宿主间存在复杂的相互作用关系。群体感应淬灭机制在发挥抗菌作用的同时,对肠道微生态系统的作用规律尚未知晓,亟需进行科学的研究与评价。本论文通过高通量测序与宏基因组技术,研究了外源添加群体感应淬灭酶YtnP对草鱼肠道菌群多样性及其相关功能基因的影响,揭示了群体感应淬灭作用与宿主肠道菌群间的相互关系,为其在水产养殖上应用提供理论依据。1.单一添加群体感应淬灭酶YtnP对草鱼肠道菌群的作用规律选取30条体重25±1g的草鱼随机分为两组,每组三个平行,试验组注射体积100μL浓度为25μg/m L的的重组纯化YtnP,进行了周期48h的急性试验。在试验的24 h、48 h分别采取草鱼肠道及内容物进行16S r RNA测序。结果表明对照组和试验组样品的OTU分别为142±102和143±67;试验组肠道菌群的Alpha多样性指数差异均不显著(P>0.05);Beta多样性分析显示对照组与试验组间菌群特点存在差异。此外,在门分类水平上两组优势菌群均为放线菌门、梭杆菌门、变形菌门,且试验组浮霉菌门(P<0.05)丰度显著增加;属分类水平上两组优势菌群均为鲸杆菌属、诺卡氏菌属,且试验组微杆菌属(P<0.05)丰度显著增加。2.草鱼感染嗜水气单胞菌条件下,YtnP对草鱼肠道菌群影响的时空变化规律选取300条体重28±2g的草鱼随机分成空白对照组(Contr组)、阴性对照组嗜水气单胞菌组(AH组)、阳性对照群体感应淬灭组(YtnP组)和试验共感染组(AY组)四个组,每组三个平行,分别注射体积为100μL的缓冲液(50%PBS,50%分子筛)、浓度为3×106CFU/m L Aeromonas.hydrophila ATCC7966、浓度为25μg/m L YtnP以及AH和YtnP的混合液,在试验的第1天、3天、5天、7天分别采取草鱼肠道样品进行16S r RNA测序,并将第3天的样品进行宏基因组测序。结果显示各试验组Alpha多样性无显著差异(P>0.05),Beta多样性主坐标分析(Pco A)显示各组间菌群存在显著差异(P<0.05)。在门分类水平上,组间丰度时空变化规律为:(1)YtnP组变形菌门先减后增,放线菌门、梭杆菌门先增后减;酸杆菌门、蓝细菌门显著递增(P<0.05),且变形菌门、中肠厚壁菌门总体丰度显著增加(P<0.05);(2)AY组变形菌门先增后减,放线菌门、梭杆菌门、浮霉菌门先减后增。在属分类水平上:(1)YtnP组第5天气单胞菌属显著降低,弧菌属显著递减;红球菌属总体显著增加(P<0.05);(2)AY组第5天气单胞菌属显著降低;乳酸杆菌属第7天显著增加,红球菌属总体显著增加(P<0.05)。LEfse分析显示组间所有层级有显著性差异的物种(biomarker)(P<0.05),且AY组优势物种最多。PICRUSt 2分析了菌群功能/基因家族的变化(置信区间95%,P<0.05),结果显示:(1)YtnP组显著上调了溶菌酶、抗毒素(Hig A,maz E)等功能;(2)AY组显著上调了肠杆菌素(enterobactin)的生物合成及邻苯二酚(Catechol)的降解等功能。此外,宏基因组测序分析显示AY相比AH组显著上调了37个Unigene(P<0.05),且与肠道-共生菌的稳态有关。3.YtnP对草鱼机体免疫应答的时空变化规律对照组、AH组、YtnP组和AY组注射后的第1天、3天、5天、7天分别采取肠道、头肾、脾脏,提取RNA逆转录为c DNA,测定相关免疫因子的变化;(1)肠道组织样品分析结果显示,AY组第1天显著上调IFN-γ1(P<0.05),AY、YtnP组第5天均显著上调多功能因子IL-15、IL-6的表达(P<0.05),而AH组各时间段主要抑制其表达(P<0.05);三组均能显著上调促炎因子IL-1β、TNF-α的表达(P<0.05),而7天时YtnP抑制TNF-α的表达;此外第1、3天AY组和YtnP组可以显著上调抑炎因子IL-10(P<0.05);(2)头肾组织样品分析结果显示,YtnP组IFN-γ1、I L-15均先上调后下调,AY组则抑制其表达;AH组能显著上调促炎因子IL-1β、T NF-α的表达,而AY抑制其表达(P<0.05);第3天,YtnP可以显著上调抑炎因子I L-10(P<0.05);(3)脾脏组织样品分析结果显示,三组IL-6均呈现出显著上调的趋势,第5天AY组可以显著抑制其表达;三组IL-15均先下调后上调;三组均能显著上调促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-8及抑炎因子IL-10、TGF-β1的表达,趋势均为先下调后上调,且7天时YtnP组上调IL-10高达28倍(P<0.01)。基因变化的总水平表明YtnP组、AY组抑炎效应增强。4.YtnP对草鱼机体免疫应答的体外调节作用挑取4条体重500±50g的草鱼,通过Percoll分离法分离头肾、脾脏、鳃的原代白细胞,给与终浓度为2ng/m L、20ng/m L、200ng/m L的YtnP处理,12h后收取贴壁细胞,提取RNA逆转录为c DNA,测定相关免疫因子的变化。结果显示:(1)在头肾白细胞中,YtnP调节作用显著,尤其是IFN-γ1极显著上调高达212倍(P<0.001),多功能因子IL-6和IL-15不同浓度均显著上调;2ng/m L和20ng/m L浓度促炎因子IL-1β、IL-8、TNF-α上调极显著(P<0.01),200ng/m L浓度促炎效应降低。抑炎因子TGF-β1、IL-10、IL-21的表达随YtnP浓度递增而递增,且IL-10由无显著性变化到极显著上调表达(P<0.001);(2)在脾脏白细胞中,YtnP同时抑制了促炎和抑炎因子的表达,且抑制IL-1β、IL-10、IL-15效果明显,但是2ng/m LYtnP显著上调了IFN-γ1和IL-6(P<0.05);(3)在鳃白细胞中,200ng/m LYtnP诱导IL-10和IL-6显著上调(P<0.01)。综合分析表明YtnP能够提高草鱼的抗感染能力和肠道微生态平衡,揭示了YtnP与宿主肠道菌群及免疫间的作用关系,为其科学应用奠定理论基础。