目的：　　 矽肺(silicosis)是由于生产过程中长期吸入游离二氧化硅含量较高的粉尘而引起肺组织炎症和纤维化的职业性疾病，是主要的尘肺病类型。矽尘导致的肺部炎症是肺组织纤维化的病理基础，探讨此类炎症的免疫学机制将为矽肺纤维化的预防和有效控制提供新的理论依据。　　 天然免疫（例如巨噬细胞）及适应免疫（例如Th1、Th2淋巴细胞）在矽尘诱发的肺部炎症中均有重要作用。天然免疫过程通常起始于外来物质与巨噬细胞之间的接触。矽尘可以刺激巨噬细胞合成细胞因子前IL-1β，前IL-1β通过NALP3炎症小体活化并释放到细胞外。这一反应将启动适应免疫进程，并伴随着一系列肺部炎症，包括:炎症细胞浸润、增殖及胞外基质沉积等。　　 继Th1细胞及Th2细胞后，人们新近发现了一群新的适应免疫细胞亚群Th17细胞。它可以分泌IL-17A（通常被称为IL-17），IL-17F及IL-22。Th17通过招募中性粒细胞和其它细胞因子，在许多肺部的炎症和疾病中发挥重要作用。 IL-1β是促Th17细胞分化的关键因子之一。RORγt是Th17关键转录因子。CD4+CD25+T细胞，又叫调节性T细胞，在免疫稳态及平衡中起到一个免疫抑制功能的细胞亚群。有些研究者认为Tregs会抑制Th17细胞的分化;另一些则认为Tregs可以促进Th17的分化。　　 肺部炎症是许多纤维化型肺部疾病的共同特征，但矽尘诱发肺部炎症的深层免疫机制，尤其是炎症过程中矽尘诱发适应免疫的发展进程以及天然免疫和适应免疫之间的关系还没有探明。本研究中，我们首先确立Tregs在矽肺小鼠Th17极化过程中的效应及调控机制。为探讨天然免疫及适应免疫间的深层机制，我们用小鼠矽肺模型验证肺泡巨噬细胞分泌IL-1β情况;通过应用IL-1Ra(anakinra)发现了IL-1β调控Th17细胞分化间的机制;通过应用抗IL-17A单克隆抗体证实了Th17型反应在矽尘诱发早期肺部炎症中的促炎作用并探讨了其作用的深层机制。　　 实验方法：　　 一、建立Tregs消除、IL-17中和及IL-1R阻滞小鼠矽肺模型　　 C57BL/6小鼠（6-8周，雌性）按体重随机分组。Tregs消除矽肺模型组小鼠经腹腔注射100μl anti-CD25 mAb，消除小鼠体内Tregs;单纯矽肺模型组、对照组C57BL/6小鼠腹腔注射等体积的IgG1同型对照抗体。IL-17中和矽肺模型组小鼠经腹腔注射100μl anti-IL17 mAb，中和小鼠体内IL-17;单纯矽肺模型组小鼠腹腔注射等体积的IgG1同型对照抗体。IL-1β受体阻滞模型组小鼠经腹腔注射1mgIL-1 Ra(anakinra)，阻滞IL-1β生理功能;单纯矽肺模型组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。矽肺模型组和生理盐水对照组小鼠分别气管内灌注二氧化硅颗粒悬液(2.5mg/50μl)或等量生理盐水。将各组C57BL/6小鼠分别于灌注后3，7，28，56天或1，4，11天处死，收集BALF;摘取肺门淋巴结、脾组织，分别制备单细胞悬液。摘取肺脏，部分保存于-80℃;部分甲醛固定，用于病理实验。　　 二、巨噬细胞分离培养　　 离心收集肺泡盥洗液中细胞，5X105/ml，1ml/孔，24孔板培养，贴壁2小时分离纯化巨噬细胞。收集贴壁巨噬，5X105/ml，1ml/孔，24孔板培养24小时。分别收集细胞和培养上清，冻存于-80℃，　　 三、炎性细胞分类计数　　 将各组动物各个时间点收集的BALF500rpm，4℃，离心10min，收集细胞，制备单细胞悬液，取10μl细胞悬液置于细胞计数板上，进行细胞计数。细胞数=(四个大格的细胞总数/4)×104。取400μl细胞悬液，室温1500rpm离心8min，弃上清，加入200μl小牛血清混匀，推片，室温晾干，用甲醇固定，37℃温箱过夜，用Giemsa染液染色，室温15min;蒸馏水背冲，晾干。油镜下计数200个细胞中巨噬细胞，中性粒细胞，淋巴细胞的数量。　　 四、病理切片染色　　 肺组织常规石蜡切片(5μm)，进行H&E染色，石蜡切片放入烘箱内烘烤2小时;然后将肺组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10 min;梯度浓度酒精浸泡各1 min，脱去二甲苯;流水冲洗5 min;苏木精染色液浸染10min，自来水冲洗，返蓝;2％盐酸酒精20s至1min;自来水冲洗12到24h;0.5％伊红染液浸染1至2 min，流水冲洗;梯度浓度酒精脱水;二甲苯透明，中性树胶封片。观察小鼠肺组织肺间质炎性细胞侵润及肉芽肿的形成改变。　　 五、流式细胞技术　　 取BALF、脾、肺门淋巴结细胞各1×106个，应用anti-CD3-Percp，anti-CD4-PE-CY7，anti-CD25-APC荧光抗体，4℃条件下避光孵育30min，3％FBS的PBS清洗细胞两次，破膜液孵育细胞30min，再次清洗细胞两次，应用anti-Foxp3-FITC荧光抗体孵育细胞1h，进行胞内染色。清洗后，加入1％多聚甲醛的PBS300μl，混匀，FACSCantoⅡ流式细胞仪检测，Diva软件进行分析。　　 取脾、肺门淋巴结细胞各1×106个，3％FBS的PBS清洗细胞两次，固定液固定30min，破膜液清洗一次，破膜液孵育细胞30min，再次清洗细胞两次，应用anti-IFN-γ-Alexa Fluor488, anti-CD4-PerCP-Cy5.5,anti-IL-17A-PE, anti-Foxp3-Alexa Fluor647荧光抗体，室温条件下避光孵育30min。清洗后，加入1％多聚甲醛的PBS300μl，混匀，FACSCantoⅡ流式细胞仪检测，Diva软件进行分析。　　 六、实时荧光定量PCR(Realtime PCR)　　 取100mg肺组织，加入1ml Trizol试剂，冰浴匀浆，12000rpm离心10min，将上清转移至新管中，室温静置5 min;每管加入200μl氯仿，用力震荡30秒，室温静置3min;4℃，12000rpm，离心15 min;吸取上清至新的1.5ml EP管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后室温沉淀10 min;4℃，12000rpm离心10 min后，弃上清;加入4℃预冷的75％乙醇1ml，洗涤沉淀及离心管壁;4℃，7500rpm离心5 min，弃上清;室温干燥15分钟;加入30μl RNase-free水，至完全溶解，测定RNA浓度。应用Takara公司逆转录酶，将2μg RNA逆转录成cDNA，用ABI7500 Realtime PCR仪定量测定，相对定量法计算基因的表达水平。　　 七、酶联免疫吸附试验(ELISA)　　 应用eBioscience公司的试剂盒检测，用100-μl包被抗体孵育96孔板，4℃过夜，洗板，200μl检测稀释液室温阻断1h，洗板，加入100μl不同浓度标准品或样品室温孵育2h，洗板，加入检测抗体100μl室温1h，洗板，加入辣根过氧化物酶100μl室温30min，加入底物室温孵育15min，加入终止液，450nm处读板，检测细胞因子的分泌水平。　　 八、免疫荧光检测　　 肺组织切片用0.1M PBS清洗两次，用羊血清(Histostain-Plus Kits，ZSBG-BIO)孵育30min以降低非特异性结合。用anti-CD4-PE-CY7染料(BD Pharmingen，SanJose，CA，USA)4℃孵育切片过夜。PBS洗三次，用anti-IL17A-AF488染料(eBioscience，San Diego，CA92121，USA)室温孵育2h，共聚焦激光扫描显微镜(TCS sp2/AOBS，LEICA)观察切片，拍摄图片，Leica共聚焦软件分析切片中表达CD4+IL-17A+细胞。　　 九、免疫组化检测　　 肺组织切片用0.1M PBS清洗两次，1％ H2O2室温10孵育分钟。0.1M PBS清洗两次，用羊血清(Histostain-Plus Kits，ZSBG-BIO)孵育30min以降低非特异性结合。用anti-TGF-β1 sc-146和anti-IL-1β sc-7884(SANTA CRUZ BIO，UnitedStates)室温孵育1h。PBS洗三次，二抗孵育30min(Histostain-Plus Kits9001，ZSBG-BIO)，正置显微镜(Eclipse80i，Nikon)观察切片，拍摄图片，NIS软件包分析切片中蛋白阳性表达。　　 十、统计学分析　　 数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析，统计结果表示为mean(±)S.E.M，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异;当差异有统计学意义时，用SNK法进行组间比较，相关性用Pearsons correlation coefficients法检验。p＜0.05具有统计学意义。　　 实验结果　　 一、Tregs抑制小鼠矽肺模型中性粒细胞型炎症　　 Tregs消除矽肺组小鼠腹腔注射抗CD25单克隆抗体，单纯矽肺模型组及生理盐水对照组小鼠腹腔注射抗IgG1同型对照抗体。气管内分别灌注二氧化硅颗粒悬液或生理盐水。经流式细胞技术检测，抗CD25单克隆抗体有效消除矽肺小鼠脾、淋巴结及肺泡盥洗液细胞中CD4+CD25+Tregs。Tregs消除组调节性T细胞的功能性表型Foxp3和CTLA-4占CD4+CD25+细胞比例较矽肺模型组、生理盐水对照组小鼠显著降低，差别具有统计学意义。腹腔注射CD25抗体从表型和功能上均有效的消除了小鼠体内Tregs。Tregs消除小鼠矽肺模型中支气管周围肺部炎症明显增加。肺泡盥洗液中炎性细胞尤其中性粒细胞增加。Tregs消除增强了矽尘诱发肺部早期中性粒细胞型炎症。　　 二、Tregs促进小鼠矽肺模型中Th17型反应　　 Tregs消除明显降低了7天、28天小鼠矽肺模型中Th17转录因子RORγt肺部mRNA的表达。Tregs消除组IL-17的mRNA水平较单纯矽肺模型组从3天开始显著降低。Tregs消除抑制了矽肺模型中的Th17型反应。免疫荧光结果显示，一些CD4+（红色）的T细胞表达IL-17A（绿色）;且不是所有的表达IL-17A的细胞都是CD4阳性的。矽肺模型组中CD4阳性IL-17A阳性的细胞(Th17)较生理盐水对照组7天时明显增加;Tregs消除组和生理盐水对照组比较3天河7天都没有明显区别。在Tregs消除组中7天CD4阳性IL-17A阳性细胞比单纯矽肺模型组中低，但是3天是没有明显区别。　　 三、Tregs通过调控TGF-β1和IL-1β促进Th17细胞分化　　 矽肺小鼠肺部IL-10mRNA表达增加，Tregs消除降低了矽尘诱导IL-10表达增加的这种趋势。Tregs消除组TGF-β1 mRNA水平较矽肺模型组降低显著。Tregs消除组TGF-β1蛋白水平较矽肺模型组也明显降低。ELISA检测肺泡盥洗液中IL-10和TGF-β1的蛋白水平，结果显示了相同的趋势。Tregs消除组IL-1β mRNA水平较矽肺模型组明显降低。IL-1β的免疫组织化学检测结果显示Tregs消除组IL-1β蛋白水平较矽肺模型组降低。Tregs消除降低了矽肺小鼠中IL-1β的水平。以上结果提示TGF-β1和IL-1β可能在Th17的分化过程中起作用。　　 虽然Tregs消除组IL-6mRNA表达增加，但Th17的分化仍被抑制。Tregs消除组的IL-23水平较矽肺模型组没有明显的改变。因此，在小鼠矽肺模型中，Tregs可能不通过IL-6和IL-23来影响Th17分化。　　 Tregs消除组3天时间点IL-2表达水平较矽肺模型组和生理盐水对照组增加显著。Tregs消除组和矽肺模型组IFN-γ较生理盐水对照组增加，但只有Tregs消除组有统计学意义。Tregs消除组和矽肺模型组IL-12mRNA水平3天明显增加。Tregs消除组IL-4mRNA水平明显降低。增强的Th1型反应可能抑制了Th17分化和IL-17分泌。　　 四、矽尘诱导肺泡巨噬细胞IL-1β表达及小鼠Th17、Th1型反应矽尘处理1天后小鼠肺泡巨噬细胞表达的IL-1β mRNA水平明显增加。矽肺模型组较生理盐水对照组小鼠的肺泡巨噬细胞分泌更多的IL-1β。矽肺模型小鼠脾及肺门淋巴结中Th17细胞的百分比较生理盐水对照组1天和4天明显增加，尤其1天最为显著。流式结果显示，矽尘暴露后Th17细胞分化情况在起始时最高然后逐渐降低。矽尘暴露后巨噬细胞分泌的IL-1β和脾中Th17细胞比例之间相关性显著。矽肺暴露小鼠脾中和淋巴结中Th1型细胞的百分比也明显增加。但是Th1细胞比例和巨噬细胞分泌的IL-1β间的相关性不显著。这些结果提示小鼠模型中Th17细胞的分化与肺泡巨噬细胞分泌的IL-1β相关。　　 五、IL-1β通过诱导Th17分化启动适应性免疫　　 1天、11天受体阻滞矽肺组较矽肺模型对照组IL-1β水平升高显著，意味着阻滞剂(anakinra)有效阻滞了IL-1β与IL-1受体结合。Anakinra明显降低了脾中和淋巴结中Th17细胞的百分比。阻滞剂组IL-17和RORγ-t的mRNA表达也明显降低。阻滞剂组肺组织中IL-17蛋白水平也明显降低。这些结果提示IL-1β可以通过IL-1RI调控Th17细胞的分化。Anakinra对Th1分化没有太大的影响。　　 病理结果显示受体阻滞矽肺小鼠较矽肺模型对照组的肺部炎症降低。阻滞剂组肺泡盥沈液中总细胞和中性粒细胞1天4天均显著降低。Anakinra也降低了盥洗液中淋巴细胞和巨噬细胞的聚集。肺泡盥洗液炎性细胞分类计数结果也证实了阻滞剂减轻了矽尘诱发的肺部炎症。　　 六、Th17介导矽肺早期肺部炎症　　 肺组织匀浆ELISA结果显示，抗IL-17A单克隆抗体有效的中和了肺组织中IL-17A。矽肺抗体组脾中Th17细胞较同型对照矽肺模型组降低且有统计学意义。抗IL-17A单克隆抗体也明显降低了矽尘诱发的肺部炎症。肺泡盥洗液炎性细胞分类计数结果显示IL-17A中和降低了总细胞数。1天和4天矽肺抗体组肺泡盥洗液中中性粒细胞较矽肺同型对照组降低且有统计学意义，淋巴细胞和巨噬细胞也有不同程度降低。这些结果说明Th17型反应在矽肺早期肺部炎症中起了重要的作用。　　 七、Th17通过影响Th1和Tregs调控矽肺Th免疫应答　　 IL-17A中和增加了矽肺模型早期Th1型转录因子T-bet的表达。IL-17A中和组脾组织中CD4+IFN-γ+ Th1型细胞较同型对照抗体组增加，11天有显著意义。IL-17A中和组淋巴结中CD4+IFN-γ+ Th1细胞较同型对照抗体组也增加。　　 IL-17A中和增加了矽肺小鼠脾中Tregs转录因子Foxp3的表达。流式结果显示IL-17A中和组脾和淋巴结中Tregs表达均升高。IL-17A中和组中升高的Tregs可能降低了矽尘诱发的肺部炎症。　　 八、Th17通过IL-22和IL-1β调节矽肺早期炎症　　 IL-17A中和矽肺模型小鼠脾中IL-22mRNA表达升高且较矽肺模型对照组有显著意义。IL-17A中和矽肺模型组肺组织中IL-22mRNA表达也升高且较矽肺模型对照组有显著意义。IL-17A中和将增加小鼠矽肺模型中IL-22的表达。IL-17A中和后，小鼠矽肺模型脾中IL-1β mRNA表达降低且有统计学意义。IL-17A中和同样降低了小鼠矽肺模型肺组织中IL-1β的mRNA表达。这些结果提示IL-17可能通过影响IL-22和IL-1β促进矽尘诱发肺部炎症。　　 结论：　　 1、Tregs促进小鼠矽肺模型中Th17细胞的分化。　　 2、IL-1β通过IL-1RI诱导Th17分化，进而启动适应免疫进程。　　 3、Th17型反应通过调控IL-1β、IL-22和Th免疫反应和进而影响矽肺早期炎症。