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变形杆菌是一种食源性条件致病菌,吃剩下的食物、食品沙拉和一些豆类制品,还有动物的内脏及肉、蛋类等一系列的动物性食品都很容易被变形杆菌污染,从而导致食物中毒。感染变形杆菌可以导致急性胃肠炎或者组胺中毒,致使身体的抵抗力变弱,身体的某些部位极易被感染和病变,如:败血症,呼吸道感染,尿路感染,此外还能引起脑膜炎,腹膜炎,类风湿关节炎等疾病。目前检测变形杆菌的方法有很多,有的方法操作过于复杂,检测过程耗时很长,无法实现食品中变形杆菌快速检测。还有些方法所需要的检测仪器相对比较昂贵,在一些中小企业难以推广。因此研究变形杆菌高效、灵敏,方便快捷的新型检测法极为重要。变形杆菌属现有5个种:普通变形杆菌、奇异变形杆菌、产黏变形杆菌、潘氏变形杆菌和豪氏变形杆菌,在变形杆菌食物中毒中最为常见的感染是由奇异变形杆菌引起的,普通变形杆菌次之,本文主要对普通变形杆菌和奇异变形杆菌进行研宄。2000年,日本荣研化学株式会Notomi等人研发出一种新型的能够在体外进行恒温扩增核酸片段的技术环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,简称LAMP),这一技术的特点就是根据鞋1基因序列的6个位置区域,设计出4种具有特异性的引物,其中包含着外引物F3和B3及内引物FIP和BIP?然后在DNA聚合酶(5对DMA polymerase)催化作用下等温(65°C左右)持续数十分钟,就能够完成核酸的扩增。近年来出现了实时荧光监测仪?ESE Quant Tube Scanner)’它是可以对模板DNA进行等温扩增的装置。实时焚光LAMP(Real-time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification Technology.Real Amp)技术,就是将实时突光监测仪与电脑相连,再向LAMP反应体系中加入荧光染料?SYBR Green I),SYBR Green I会和双链DNA发生结合,使荧光强度大大增强。当反应开始进行,DNA不断发生扩增,反应体系中的荧光信号也随之发生变化,通过电脑软件对整个LAMP反应进行实时监测,扩增曲线就会被显示出来,扩增曲线开始出峰的吋间越早、峰值越高,说明实时荧光LAMP反应的扩增效率也相对越高。将实时荧光监测仪与电脑相连,可实时监控并直观判定检测结果。本研究对Gen Bank中己公布的变形杆菌Mp D基因(普通变形杆菌AY134488?奇异变形杆菌AX109601)序列进行同源性对比分析,针对靶序列6个位点,运用LAMP引物设计软件(V3)进行在线引物设计。设计的4条引物包括:2条外引物(F3和B3)?2条内引物(FIP和BIP)。利用实时荧光监测仪对模板DNA进行等温扩增,通过与电脑进行相连,实时监测并直观判定检测结果。优化反应条件,对该检测方法的特异性、灵敏度等方面进行研究,将该检测方法与普通环介导等温扩增技术?LAMP)检测方法的灵敏度进行比较,并确定该方法检测变形杆菌人工污染猪肉的检出限。Real Amp产物使用限制性内切酶进行酶切,通过观察酶切片段大小来验证实时Real Amp反应的正确性。经实时荧光监测仪反复优化确定反应体系和程序。反应体系:2.5 mmol/L High Pure d NTPs 5μL,10×Thermo PolTM Reaction Buffer 3μL,50 m M Mg SO4 0.5μL,10μM F3和B3各1μL,10μM FIP和BIP各2.5μL,5 M甜菜碱0μL,8000 U/ml Bst DNA聚合酶大片段1.5μL,1.5μL SYBR GreenⅠ(1:500稀释),模板DNA 3μL,剩余为无菌蒸馏水,其可用来补足25μL反应体系。反应程序:温度为62℃,时间为60min,可以依照实际反应的情况进行终止。Real Amp检测法相比普通LAMP检测法更快速,25 min内即可判定结果;用于特异性试验的19株实验菌株中,6株变形杆菌现阳性结果,其他13株非变形杆菌,均呈阴性结果;检测纯菌的灵敏度是8.1 CFU/m L,是普通LAMP检测方法的10倍;人工污染猪肉的检出限为81 CFU/m L;通过限制性内切酶Hpa I酶切Real Amp扩增产物,测得酶切片段长度与理论值相符,验证了该反应的正确性。通过本试验而建立的Real Amp检测变形杆菌的方法可实时监测并直观判定检测结果,操作简单,耗时短,特异性强、灵敏度高,实现了变形杆菌的快速检测需要,非常有利于基层检验检疫机构应用到实际中。