水稻(Oryzasativa L.)作为我国最重要的粮食作物,水稻的品质和产量与人们生活息息相关,其中对水稻基因功能的研究尤为重要。生长调节因子(GRF)是一类小且编码植物特异性的转录因子家族。本课题组前期的研究表明,低磷胁迫能导致水稻形态的重塑,这种形态重塑主要包括根系的加长和分蘖的减少。同时,转录组测序的结果表明,低磷胁迫显著诱导水稻OsGRF1基因的表达。本研究运用CRISPR/Cas 9基因编辑技术对低磷敏感型水稻品种通粳981 OsGRF1基因进行敲除突变,研究OsGRF1基因敲除突变对水稻形态性状的影响,分析产生这些影响的可能机制,并同时探讨OsGRF1基因在低磷胁迫导致水稻形态重塑中的作用。1.OsGRF1基因敲除突变体的构建与鉴定对水稻通粳981 OsGRF1基因全长进行扩增和测序后,与RAP-DB网络上所报道的水稻OsGRF1基因组序列进行比对,发现通粳981 OsGRF1基因编码区产生两处单核苷酸替换,一处缺失单个谷氨酰胺。利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术对供试水稻品种通粳981进行OsGRF1基因敲除突变,从而在获得的60株组培苗中筛选出52株阳性苗,阳性率为85%,经鉴定有36株为纯合突变体。选用单个碱基插入的23号(M23),大片段删除14号(M14)这两个OsGRF1基因敲除突变体作为试验对象进行后续试验。2.Osgrf1突变体形态与产量性状的变化与野生型相比,OsGRF1基因敲除导致突变体分蘖数增多,株高降低,叶片变短变窄,开花时间延迟,发育后期根长变短;这些形态差异表明,OsGRF1基因正调控水稻根长、株高、叶长叶宽及开花时间;OsGRF1基因负调控水稻分蘖。同时,与对照相比,低磷处理导致供试水稻分蘖数大幅下降,根系加长。由此认为,由于OsGRF1基因负调控水稻分蘖,因此在低磷胁迫下水稻分蘖的减少是由于低磷胁迫显著诱导水稻OsGRF1基因表达上调所致。OsGRF1基因敲除突变导致水稻根系变短,即OsGRF1基因正调控水稻根长,这在一定程度上解释了在低磷处理下水稻根系加长的部分原因是由于低磷导致OsGRF1基因上调表达所致。与野生型相比,OsGRF1基因敲除突变体有效穗数增多,穗长变短,结实率有所下降,籽粒体积变小,千粒重下降。表明OsGRF1基因负调控有效穗数,OsGRF1基因正调控穗长、结实率、籽粒体积及千粒重。且低磷处理导致野生型和突变体有效穗数大幅减少,因此在低磷条件下OsGRF1基因的表达上调是低磷抑制水稻有效穗数的重要机制。3.Osgrf1两个突变体中基因表达的变化及qRT-PCR验证(1)Osgrf1突变体中的上调表达基因经illumina表达谱测序发现,OsGRF1基因敲除明显导致突变体中六类基因的表达上调,它们分别是:转录因子基因、壁相关受体激酶基因、细胞数调节子基因、磷转运蛋白基因、钙调素结合蛋白基因、激素代谢和应答基因。这些基因中的大多数为两个敲除突变体共同上调表达基因。其中,OsGRF1基因敲除导致上调表达的转录因子基因包括:WRKY家族转录因子、NAC转录因子、乙烯应答转录因子、热激转录因子、bHLH转录因子、转录因子RAX2等基因。这些转录因子在植物生长发育调控及对逆境胁迫的应答中起重要作用,因此,这些转录因子的表达上调在调控OsGRF1基因敲除对水稻性状的影响中发挥了相应的作用。且OsGRF1基因敲除导致转录因子RAX2的表达上调是OsGRF1基因敲除促进水稻分蘖增多的与基因表达相关的重要原因之一。在OsGRF1基因敲除所导致上调表达的与激素代谢相关的基因中包括:促进生长素、乙烯、茉莉酸生物合成的基因,促进细胞分裂素、赤霉素、茉莉酸、油菜素内酯在有生物活性和无生物活性之间的相互转化的基因。显然,这些基因的上调表达影响了 OsGRF1基因敲除突变体中植物激素的合成和转化。(2)Osgrf1突变体中的下调表达基因经illumina表达谱测序发现,OsGRF1基因敲除最为明显地导致突变体中二类基因的显著下调表达,这两类基因分别是:转录因子基因、五环肽重复域含有蛋白基因。这些基因中的多数为两个敲除突变体共同下调表达基因。在OsGRF1基因敲除所导致下调表达的转录因子基因包括:bHLH转录因子、MADS-box转录因子、锌指蛋白、同源域一亮氨酸拉链蛋白、OFP转录因子、TCP转录因子等基因。其中,MADS-box转录因子和锌指蛋白基因的表达下调是OsGRF1基因敲除导致突变体延迟开花时间的重要因素。转录因子基因OsTCP15的表达的下调可能是导致OsGRF1基因敲除突变体叶长变短、茎秆矮化的原因之一。OsGRF1基因敲除所导致的五环肽重复域含有蛋白基因表达下调能影响OsGRF1基因敲除突变体中RNA的加工过程,进而影响基因转录后的修饰和基因的表达。(3)差异表达基因的qRT-PCR验证选定15个表达谱测序所揭示差异表达基因,对其转录水平进行qRT-PCR验证,验证的结果与表达谱测序结果相一致,说明表达谱测序结果可信。4.Osgrf1突变体中重要生理生化指标的变化与野生型相比,OsGRF1基因敲除突变体地上部总磷含量升高,根系活力增强,抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均出现下降(低磷条件下降幅度更大);这表明,OsGRF1基因敲除突变能促进水稻对磷的吸收,导致根系活力的增高,但导致抗氧化能力下降。这表明,OsGRF1基因负调控水稻对磷的吸收能力和根系活力,但正调控抗氧化能力。和正常磷处理相比,低磷处理导致地上部总磷含量大幅下降,根系活力降低。5.Osgrf1突变体中水稻内源激素含量的变化对7种植物内源激素含量的测定发现,OsGRF1基因敲除能导致促生长类植物激素IAA、GA和CTK在突变体地上部的含量较野生型显著升高,但导致其在根系中的含量较野生型显著降低;OsGRF1基因敲除能导致与逆境抗性相关的植物激素JA和SA在突变体地上部和根系中的含量均较野生型显著降低;OsGRF1基因敲除能导致ABA在突变体地上部和根系中的含量均较野生型显著升高;OsGRF1基因敲除能导致ETH在突变体地上部的含量较野生型显著降低,而在根系中的含量较野生型显著升高。其中,突变体地上部CTK含量较野生型的大幅提高可能是OsGRF1基因敲除促进突变体分蘖增多在激素调控方面的主要原因之一。OsGRF1基因敲除能导致促生长类植物激素IAA、GA和CTK在根系中的含量较野生型显著降低,这可能是OsGRF1基因敲除导致突变体在生长后期根长较野生型变短的与激素调控相关的原因之一。突变体地上部和根系中的ABA含量较野生型的升高显然是OsGRF1基因敲除导致叶长、根长变短及株高下降的与激素调控相关的原因之一。综上所述,通过OsGRF1突变体的构建,对性状及生理生化指标影响的分析,illumina表达谱测序,结果表明,水稻OsGRF1基因能调控水稻生长发育的多个方面,其调控机制与基因表达及激素调节相关。且OsGRF1基因在低磷胁迫所导致的水稻形态重塑中也有重要的作用。