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目的采用基因工程和分子生物学的方法，构建体外稳定表达的Toll样受体4（TLR4）、髓样分化蛋白-2（MD2）和白细胞分化抗原14（CD14）基因细胞学模型，为医用注射类药物的热原检测提供一种简便可行的实验室技术方法。方法1.目的基因的克隆：以pcDNA.3.1-TLR4-YFP质粒为模板，大体系PCR得到TLR4的DNA片段，回收PCR产物连接于pMD19-T载体上进行克隆。取人外周血单核细胞总RNA，利用RT-PCR得到MD2和CD14的DNA片段，回收PCR产物连接于pMD19-T载体上进行克隆。2.表达载体的构建：经过基因序列分析鉴定的pMD19-T-TLR4与pCAG-GFP表达载体同时进行KpnI和SmaI双酶切，将回收片段进行连接，构建成pCAG-GFP-TLR4表达载体质粒；pMD19-T-MD2克隆载体与pCAG-GFP表达载体同时进行KpnI和EcoRI双酶切，将回收片段进行连接，构建成pCAG-GFP-MD2表达载体质粒；pMD19-T-CD14载体质粒与pCAG-GFP载体质粒同时进行KpnI和EcoRI双酶切，将回收片段进行连接，构建成pCAG-GFP-CD14载体质粒。3.质粒的转染及表达检测：构建成功的pCAG-GFP-TLR4、pCAG-GFP-MD2和pCAG-GFP-CD14表达载体质粒通过电转染的方法转染至PC-3M、HIT细胞系，转染后培养细胞48h，在荧光倒置显微镜下观察GFP的表达情况。结果1.利用pcDNA.3.1-TLR4-YFP质粒为模板成功获得人TLR4的DNA，成功构建pMD19-T-TLR4克隆载体质粒，经酶切、测序及BLAST鉴定序列无误。2.利用RT-PCR成功获得人MD2和CD14的DNA，成功构建pMD19-T-MD2、pMD19-T-CD14克隆载体质粒，经酶切、测序及BLAST鉴定序列无误。3.成功构建pCAG-GFP-TLR4、pCAG-GFP-MD2和pCAG-GFP-CD14表达载体质粒，经酶切、测序及BLAST鉴定序列无误。4.将构建成功的pCAG-GFP-TLR4、pCAG-GFP-MD2和pCAG-GFP-CD14表达载体质粒通过电转染的方法转染至PC-3M、HIT细胞后，培养细胞48h，在荧光倒置显微镜下细胞观察到了GFP的表达，表明质粒在体外培养条件下成功表达。结论成功构建与热原反应相关基因的表达载体，即人TLR4、MD2和CD14基因的真核表达载体pCAG-GFP-TLR4、 pCAG-GFP-MD2和pCAG-GFP-CD14，并将其转染入PC-3M、HIT细胞获得表达，为构建热原检测细胞模型做好了前期准备。目的观察四种经化学合成的三萜类新化合物（命名为H0801、H0805、H0806、H0811）对顺铂(DDP)诱导大鼠急性肾损伤保护作用并探讨对其可能作用机制。方法1.观察四种三萜类新化合物对顺铂诱导大鼠急性肾损伤保护作用①采用顺铂(6mg/kg)单次腹腔注射的方法制造顺铂肾毒性模型。②给药期间监测大鼠饮食、饮水、毛色及体重变化情况，并于造模后第5天称重，采血，处死动物。③处死大鼠后，取两侧肾脏，称重，计算肾脏系数。④制备肾组织切片，进行碘酸六胺银（Periodic acid-silver metheramine,PASM）染色，拍照并进行组织形态学观察。⑤检测血清中的血清尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）及肌酐（Serumcreatinine，Scr）含量。2.探讨四种三萜类新化合物对顺铂诱导大鼠急性肾损伤保护作用可能的作用机制。检测三萜类新化合物对大鼠肾组织匀浆中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)活性和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性的影响。结果1.三萜类新化合物对顺铂诱导大鼠急性肾损伤保护作用与生理盐水（NS）组相比，顺铂（DDP）模型组大鼠体重进行性下降，肾脏系数增加，肾组织病理改变明显，血清中的BUN及Scr含量显著性增高(P<0.01)。四种三萜类新化合物治疗组对上述情况均有不同程度的改善作用。H0805治疗组可以使血清中BUN含量降低(P<0.05)；各三萜类新化合物治疗组均可显著性地使大鼠血清中的Scr含量下降(P<0.01)。2．三萜类新化合物对顺铂诱导大鼠急性肾损伤保护作用可能的机制与NS组相比， DDP模型组大鼠肾组织匀浆中的MDA含量增加(P<0.01);同时抑制GSH-PX和SOD活性(P<0.01, P<0.01)。而H0801和H0806可以明显提高SOD(P<0.01)，GSH-Px的活性(P<0.01)，降低MDA含量(P<0.01)，H0805、H0811也有一定的保护作用，但是效果稍差。结论四种三萜类新化合物对大鼠顺铂急性肾损伤具有良好的保护作用，其可能的作用机制与抑制羟自由基和活性氧自由基介导的氧化应激反应有关，其中H0801，H0806作用最为明显。