目的: 系膜增殖性肾炎(Mesangial proliferativeglomerulonephritis，MsPGN)是小儿原发性肾小球疾病的主要病理类型之一，其主要病理变化为肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells，GMCs)增殖及系膜基质增生，GMCs的增殖可导致肾小球系膜病变不断加重，最终肾小球硬化、肾功能丧失。近年来研究表明肾小球硬化与动脉粥样硬化(atherosclerosis：AS)在病理上的改变及发病机理上存在相似性。脂质代谢紊乱在AS独立危险因素中居首要地位，亦是肾小球系膜病变进展的重要危险因素之一。动物实验已证实低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)在肾小球硬化形成中有重要作用，能直接刺激GMCs增殖和基质增多致肾小球硬化形成。 脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]是一种富含胆固醇、类似LDL的脂质。研究表明Lp(a)水平升高是AS的独立危险因素。Lp(a)在体内被氧化修饰后，易被巨噬细胞-清道夫受体识别和摄取，导致细胞内胆固醇酯的蓄积及泡沫细胞的形成，损伤组织细胞，参与AS的病理过程。Lp(a)在肾病综合征患儿明显升高，且与患儿病情进展密切相关，提示Lp(a)可能在肾小球硬化中起一定作用。GMCs具有巨噬细胞样清道夫功能，Lp(a)是否作用于GMCs而参与肾小球硬化的发生发展值得研究。最近研究发现肾脏病时Lp(a)升高可能会导致肾脏的进一步损伤。但Lp(a)对GMCs有无作用及可能机制尚未见研究。细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)是一类能介导细胞间以及细胞与细胞外基质粘附的糖蛋白，ICAM有5种，ICAM-1是其中重要的一种，在AS发病中起着一定的作用。研究发现粘附分子及其粘附机理可能是介导肾炎时细胞浸润和增殖、细胞外基质扩张乃至肾小球硬化的分子基础。GMCs表面有低表达的工CAM-1。Lp(a)对GMCs表面ICAM-1表达是否有影响，它在GMCs增殖、肾小球硬化过程中的作用值得进一步研究。 本项目正是借助脂蛋白是AS独立危险因素，引入研究Lp(a)对GMCs增殖、ICAM-1的表达及肾小球硬化过程中的作用，为探寻治疗肾小球疾病的新途径提供科学依据。 方法: 1.大鼠GMCs培养：从液氮罐内取出大鼠GMCs系冷冻管，37℃温水水浴后离心，吸出细胞液，移入细胞培养瓶静置培养，培养液由20％胎牛血清、0.3U/ml胰岛素、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素、2.5mg/L二性霉素及D-缬氨酸改良的伊格尔培养基(Minimum Essential Medium，MEM)组成。培养瓶置于5％CO<,2>、18％O<,2>孵箱内。当系膜细胞长至贴壁时，用0.25％胰蛋白酶与0.04％乙二胺四乙酸二钠等量混合，消化细胞，传代。第3代时，用RPMI 1640代替D-缬氨酸改良的MEM，其他成分相同。 2.Lp(a)分离：通过采集定期进行LDL血浆置换患者的富含Lp(a)再生液，行超速离心(密度1.065-1.120mg/ml)，再予密度梯度离心法分离。获取的Lp(a)经150mmol/L NaCl、lmmol/L EDTA(pH 7.4)于4℃透析48h后，微孔过滤膜除菌，Sephader G 25M凝胶层析和赖氨酸-seppharose 4B层析纯化，采用0.6％琼脂糖凝胶电泳和4％的SDS-PAGE鉴定并分析纯度。储存备用。 3.MTT法测定大鼠GMCs增生率：将GMCs种入96孔板中，(2～4)×10<4>个细胞/孔，分对照组、10mg/L脂多糖(LPS)组、Lp(a)共3组，Lp(a)浓度分别为：1.25μg/L、2.5μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L。分别于培养12h、24 h、48 h、60h、72h 5个时间段后，收集培养的GMCs及悬浮液，分别测定GMCs增生率。细胞增生率=(LPS组吸光度-实验组吸光度)/LPS组吸光度。 4.GMCs中增生细胞核抗原(Proliferationg cellnuclear antigen，PCNA)表达的测定：GMCs分瓶培养，实验末，收集培养细胞，涂片，丙酮固定，免疫组化法测定PCNA表达。实验结果在显微镜下观察，分别计数每张涂片中的5个视野内(200个/每视野)GMCs的免疫染色阳性细胞数，计算其阳性率。 5.ICAM-1的测定：采用ELISA法(试剂盒购自南京建成生物工程有限公司)。两种抗ICAM-1的抗体将ICAM-1夹在中间，其中第二抗体与指示酶连接，加入色素性底物使一定量的ICAM-1显色，最后在450nm波长下测定ICAM-1的浓度。 6.统计学分析：所有计量资料均采用均数±标准差表示，组问比较采用t检验或方差分析，并行相关分析。以p<0.05为有统计意义。 结果 1.在实验末，与LPS组、对照组比较，Lp(a)组GMCs的MTT、增生细胞核抗原阳性表达率、上清ICAM-1浓度明显高于对照组，但低于LPS组。 2.随着Lp(a)剂量的增加，GMCs的MTT、增生细胞核抗原阳性表达率、上清工CAM-1浓度呈增加趋势，在Lp(a)2.5μg/L、5.0μg/L其作用达到高峰，剂量继续增加时出现下降，剂量越大，GMCs的增生受抑制越明显。 3.随着处理时间的延长，GMCs的MTT、增生细胞核抗原阳性表达率、ICAM-1浓度呈增加趋势，但随着剂量的增加，依次于72h、60h、48h逐渐出现下降。 4.GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和增生细胞核抗原阳性表达率呈正相关。 结论 1.Lp(a)能明显影响肾脏系膜细胞的增生，作用呈剂量依赖性和时间依赖性，小剂量时刺激系膜细胞的增生，大剂量则表现为细胞毒作用。 2.Lp(a)明显影响大鼠GMCs的ICAM-1表达，表达量呈剂量依赖性和时间依赖性，小剂量时Lp(a)上调大鼠GMCs的ICAM-1表达，大剂量时，大鼠GMCs的ICAM-1表达下调。 3.GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和增生细胞核抗原阳性表达率呈正相关。提示Lp(a)对肾小球系膜细胞的作用可能与ICAM-1有关。