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背景:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种单克隆浆细胞恶性增殖性血液病,高钙血症、肾功能损害、贫血及骨质破坏等是其主要的临床特征。在血液系统肿瘤中,MM的发病率位居第二位,仅次于淋巴瘤。近年来发病率逐年升高,发病年龄也日渐年轻化,严重影响了人们的生存、生活质量。治疗MM的手段主要是传统的化疗药物及不断出现的新药(硼替佐米、来那度胺、daratumumab等),尽管疾病缓解率得到明显提高,但是复发/难治的现象仍然存在,目前临床上仍然无法治愈。因此从不同角度进一步探索MM疾病发生发展的病理生理机制,寻找新的治疗靶点,期望为最终克服该疾病提供合理有效的治疗策略。近年来,肿瘤细胞的异常高代谢特征引起了广泛关注,也是与正常细胞区别的关键点之一。其中,异常的高糖代谢为肿瘤细胞的生长繁殖提供了充足的能量。从糖代谢途径中寻找靶点,或许是治疗MM的新方向。研究表明,在多种癌症中,参与糖酵解步骤的蛋白质酶类都有不同程度的过表达,其中磷酸果糖激酶-1(phosphofructokinase 1,PFK-1)是关键限速酶之一,将果糖-6-磷酸(fructose 6-bisphosphate,Fru-6-P)转变为果糖-1,6-二磷酸(fructose 1,6-bisphosphate,Fru-1,6-P2)。2,6-二磷酸果糖(fructose 2,6-bisphosphate,Fru-2,6-P2)是 PFK-1 最强有力的激活剂。其中2,6-二磷酸果糖激酶(phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase,PFKFB)的亚型 PFKFB3 促进了 Fru-2,6-P2 合成,进而促进了肿瘤的糖酵解,参与了肿瘤细胞的生存和增殖。目前研究发现,PFKFB3在胃癌、乳腺癌、头颈部肿瘤等多种恶性肿瘤中均有高表达,蛋白水平的升高与疾病的不良预后有密切关系。我们课题组前期研究发现,在MM细胞株中,PFKFB3亦呈高表达,抑制PFKFB3影响了细胞的增殖促进了细胞的凋亡,然而对MM糖酵解的影响和与之相互作用的信号传导机制并不清楚,因此本研究在前期工作的基础上深入探索PFKFB3对MM发生发展的影响及其作用机制,以糖代谢为基础为MM治疗提供新的思路和策略。目的:1.明确在原代MM细胞(患者骨髓CD138+细胞)及MM细胞株中PFKFB3的表达情况;2.抑制PFKFB3酶活性,明确其对MM细胞株糖酵解、细胞增殖等生物学行为的影响;3.构建过表达PFKFB3的慢病毒载体转染MM细胞,探讨PFKFB3影响MM细胞的具体机制;4.体内外实验进一步探索PFKFB3影响MM生长繁殖的机制。方法:1.采用Western blot、qRT-PCR法检测PFKFB3在原代MM细胞及MM细胞株(RPMI8226、OPM2、ARP-1、MM.1S)中的表达情况;2.采用CCK-8法、台盼兰拒染实验检测PFKFB3抑制剂PFK15对MM细胞株生长增殖及凋亡的影响以及相关试剂盒检测抑制PFKFB3前后糖酵解的变化;3.利用过表达PFKFB3的慢病毒转染MM细胞株(RPMI8226、OPM2),结合抑制剂PFK15探索PFKFB3影响MM涉及的信号网络通路;4.Western blot、qRT-PCR检测高糖环境MM细胞内PFKFB3的表达,基因芯片及Western blot检测降糖药二甲双胍对PFKFB3的影响;进一步CCK-8法检测PFKFB3抑制剂PFK15和二甲双胍的联合作用,利用compusyn软件验证联合效果:联合指数(combination index,CI)<1为协同作用,=1为叠加作用,>1为拮抗作用;同时流式细胞术验证两药合用时细胞凋亡情况;5.利用NOD-SCID小鼠皮下注射MM细胞株RPMI8226(1×107)构建骨髓瘤小鼠模型,加入PFK15及二甲双胍药物抑制PFKFB3,测量小鼠肿瘤体积并采用免疫组织化学染色法验证肿瘤标志蛋白及相关信号通路蛋白的变化情况。结果:1.Western blot、qRT-PCR结果示在原代MM细胞和MM细胞株(RPMI8226、OPM2、ARP-1、MM.1S)中 PFKFB3 高表达;2.CCK-8法、台盼兰拒染实验显示PFKFB3抑制剂PFK15显著抑制了 MM细胞的活力和生长增殖率;PFKFB3受抑制后,葡萄糖的吸收下降,Fru-2,6-P2的含量也下降,说明糖酵解能力减弱;同时,Western blot、qRT-PCR结果示糖酵解中相关的其他酶GLUT1、HK2表达量升高;3.流式细胞术AnnexinV/PI结果示随着PFK15浓度的升高,细胞凋亡显著增加(P<0.05);PFK15处理MM细胞株后,细胞周期阻滞于S期;凋亡细胞Tunel检测法结果亦验证了 PFK15对细胞的凋亡作用;抑制PFKFB3后,Western blot结果示促凋亡蛋白Caspase3、Bak、PARP-1和周期阻滞蛋白P21表达含量增加,周期进展相关蛋白CyclinD1及抗凋亡蛋白Mcl-1表达含量下降;4.利用过表达PFKFB3的MM细胞株结合抑制剂PFK15进一步研究发现,PFKFB3与MAPKs/STAT1信号家族呈正相关关系,即过表达PFKFB3,MAPKs(JNK P38 Erk)/STAT1信号网络被激活,反之亦然。采用P38抑制剂LY2228820发现磷酸化的P38表达量发生变化,PFKFB3含量未受影响,结果表明MAPKs信号通路位于PFKFB3的下游。此外,抑制PFKFB3,DNA损伤的标志性蛋白γH2AX的表达升高;5.高糖环境MM细胞内PFKFB3表达升高,二甲双胍抑制PFKFB3,CCK-8法、流式细胞术、compusyn软件结果分析二甲双胍和抑制剂PFK15存在联合作用(CI<1);6.体内骨髓瘤小鼠模型实验结果示:PFKFB3抑制剂PFK15抑制了肿瘤生长,与二甲双胍联用后,抑制效果更显著;免疫组织化学染色结果也取得一致结果。结论:1.骨髓瘤细胞株和原代MM细胞均表达PFKFB3;2.抑制PFKFB3后MM细胞发生凋亡,细胞周期阻滞于S期;同时糖酵解的能力下降,并负反馈调节了糖酵解通路中的相关酶类GLUT1、HK2;3.PFKFB3影响了 MM细胞增殖凋亡的机制与信号网络通路MAPKs/STAT1的异常调控有关;也与DNA损伤相关;4.高糖环境中的MM细胞高表达PFKFB3,而降糖药二甲双胍抑制了 PFKFB3的表达,进一步研究发现PFKFB3抑制剂PFK15与二甲双胍存在联合作用;5.MM荷瘤小鼠体内抑制PFKFB3,小鼠肿瘤负荷降低,PFK15与二甲双胍联用后,抑制肿瘤效果更加显著。