本研究对一株纤维素酶高产菌株XST1进行ITS分子标记鉴定,接着克隆了该菌的两个外切纤维素酶基因cbhⅠ和cbhⅡ,进一步实现了外切纤维素酶基因在毕赤酵母中的有效表达。外切纤维素酶基因的克隆及其表达,丰富了现有的纤维素酶基因资源,也为该基因的进一步改造奠定了初步的分子基础。主要的研究内容和成果包括:(1) XST1菌株的分子鉴定:克隆并测定XST1菌株的ITS序列,通过比对和聚类分析,构建系统进化树,结果表明该菌株与长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)亲缘关系最为紧密,初步鉴定为长梗木霉。(2)外切纤维素酶的基因组DNA和cDNA的克隆及序列分析:提取XST1的基因组DNA和总RNA,参照里氏木霉和绿色木霉相关基因序列设计引物,采用PCR和RT-PCR技术分别扩增了外切纤维素酶Ⅰ、Ⅱ的全长基因序列和cDNA序列。序列分析结果表明:cbhⅠ基因长1681 bp,含2个内含子(462-527 bp和1226-1294 bp);cbhⅡ基因全长1583 bp,含3个内含子(93-143 bp、528-583bp和832-894 bp)。(3)基因工程菌的构建:将cbh-cDNA序列插入表达载体pPIC3.5K,通过电击转化的方式导入毕赤酵母GS115菌株。重组菌株经0.5%甲醇诱导培养,实现了外切纤维素酶蛋白的分泌表达。SDS-PAGE分析表明,表达的酶蛋白分子量约为65kDa和67kDa左右。CMC检测平板中出现透明水解圈,工程菌发酵上清液水解CMC的最大酶活分别为26.40 U/mL和24.70 U/mL,水解pNPC的最大酶活分别为28.89 U/L和26.39 U/L。