无距虾脊兰种子萌发的生理及分子基础研究

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无距虾脊兰(Calanthe tsoongiana T.Tang et F.T.Wang)为兰科虾脊兰属多年生草本植物,为我国特有的珍稀濒危植物。兰花授粉后,单个蒴果内可发育出众多细小的种子,采收未成熟蒴果进行无菌播种可获得大量生长状态一致的幼苗,利用种子繁殖对珍稀兰花物种进行保护是我们努力的方向。另外,大多数地生兰种子离体条件下难以萌发,且兰花种子结构特殊,其萌发过程不同于一般植物。原球茎为种子萌发过程中重要的中间结构。为揭示无距虾脊兰种子萌发和幼苗形态建立的基础生理和分子机制,我们通过形态特征观察、石蜡切片技术、内源激素含量测定以及转录组测序技术对无距虾脊兰种子萌发到幼苗建立的发育过程进行了研究,具体研究结果如下:(1)通过形态特征和石蜡切片观察发现,种子吸水膨胀时,种胚内细胞体积和细胞核较大。未见表皮组织的分化。种胚突破种皮后转绿并发育成球形原球茎,含有顶端分生组织的一端细胞分裂旺盛且具有相似的形态特征,细胞不断分裂后,原球茎一端出现指状突起,叶原基形成。同时,另一端发育出透明“纤毛”,行使吸收水分和养分的功能。茎尖伸长分化期间,根原基在基部出现并不断发育形成幼根。叶原基和根原基分化成片状幼叶和根时,幼苗形态完全建成。在形态结构和解剖特征观察的基础上,将无距虾脊兰种子萌发形成幼苗的过程划分为六个发育阶段:(S0)未成熟种子阶段;(SA)吸胀活化种子阶段;(PB)球形原球茎阶段;(PC)指状原球茎阶段;(PD)根叶分化阶段;(PE)幼苗阶段。(3)以上述划分的六个时期样本为实验材料,对ABA、IAA、GA3、BR、JA-ME、IPA和ZR这七种内源激素的含量进行检测。其中,ABA、IAA、JA-ME和IPA在萌发过程中变化幅度较大,IPA在种子吸水膨胀阶段含量剧烈下降,此后保持较低的水平。IAA在整个发育过程中波动幅度较大。JA-ME含量在种子萌发后的球形原球茎阶段大幅度上升,其后保持较高的含量。IPA含量缓慢增加并在指状原球茎阶段达到巅峰。其它三种激素GA3、BR和ZR在原球茎分化过程中存在小幅度波动。因此,ABA,IAA,JA-ME and IPA可能作用于种子萌发原球茎形成过程,IAA、IPA、BR和ZR则涉及原球茎分化成幼苗这一过程。(4)采用种胚吸水膨胀到根叶分化共四个阶段的样本进行转录组测序。原始序列经处理后产生73 528条Unigenes。在公共数据库比对中,分别有48.10%、34.17%、13.53%、31.43%的基因注释到NR、Swissprot、KEGG、GO库。共设有6个比较组(PB VS SA,PC VS SA,PD VS SA,PD VS PB,PD VS PC,PC VS PB),其检测到的差异基因数量分别为:10 029、9 277、8 056、6 784、3 560、1 038。GO富集分析结果显示DEGs(差异表达基因)主要涉及细胞过程和代谢过程,KEGG代谢途径分析则显示DEGs主要参与光合作用、苯丙素生物合成、淀粉和糖代谢等。(5)进一步对差异基因进行分析,筛选到与无距虾脊兰内源激素和器官形态建成相关的基因。赤霉素合成相关基因KAO2和CPS1以及代谢基因GA2ox1在PB和SA阶段间显著差异表达。而脱落酸相关基因在无距虾脊兰中存在复杂的分子调控机制,NCED1和ZEP是决定ABA生物合成的关键基因,而CYP707A4控制ABA的代谢。TSA1和DAO分别为生长素合成和代谢基因,在本研究中呈相反的表达趋势且具有较高的表达水平。AUX1为原球茎分生组织中负责生长素转运的主要基因。ARR-A和ARR-B转录因子家族基因是细胞分裂素信号转导途径的关键基因。器官形态建成相关基因CUC2、AS1和STM存在相互作用,这三者共同调控分生组织和叶片的形成。
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