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猪α干扰素(PoIFN-α)具有广谱的抗病毒活性,在病毒病的治疗、抑制肿瘤细胞增殖和调节免疫功能等方面发挥重要作用。为了获得高活性的PoIFN-α,本研究利用生物信息学的方法对PoIFN-α亚型的基因序列进行分析,分析PoIFN-α等位氨基酸改变频率较高的位点,结合其三级结构的预测,对PoIFN-α的氨基酸位点进行定点突变。利用大肠杆菌表达系统对PoIFN-α进行表达纯化,通过抗病毒活性的测定,筛选出PoIFN-α的高效突变体并命名为PoIFN-α-156s,并对PoIFN-α-156s体内外抗病毒作用进行研究,具体内容如下:1.猪α干扰素突变体的构建、表达、纯化及结构测定为了获得高活性的PoIFN-α,在NCBI上下载不同猪α干扰素亚型的基因序列,运用生物信息学软件进行比对,分析等位基因较易改变的氨基酸位点并结合PoIFN-a三级结构预测,选择突变的位点为 38(S→F)、40(H→Q)、43(F→L)、78(N→D)、86(C→Y)、151(V→A)及156(T→R),本试验设计了 4种猪α干扰素突变体序列,分别命名为PoIFN-α-38、PoIFN-α-86、PoIFN-α-156、PoIFN-α-156s。利用融合 PCR 方法,将天然 PoIFN-α 基因进行定点突变,并克隆到pET-32a载体上,转化至大肠杆菌Rosetta中诱导表达和鉴定。结果显示,重组蛋白表达形式为包涵体,蛋白分子质量约33KDa。利用CD光谱法测定PoIFN-α-156s和PoIFN-α的二级结构,结果表明它们的二级结构中均具有α螺旋结构。本试验成功的构建了猪α干扰素突变体并在大肠杆菌中表达,为下一步研究其生物活性奠定基础。2.猪α干扰素及突变体体外生物活性测定在ST细胞和Vero细胞中利用MTT法测定POIFN-α-1 56s和PoIFN-α在细胞上的安全浓度。用细胞维持液将蛋白2倍倍比稀释后孵育细胞72h,利用MTT试剂盒检测细胞的存活率。在 Vero 细胞上 PoIFN-α-156s和PoIFN-α的CC50分别为505.8μg/mL和482.1 μg/mL,在 ST 细胞上的 CC50 分别为 385.4μg/mL 和 185.5μg/mL。利用MTT法、TCID50和荧光定量PCR方法分别在Vero细胞和ST细胞上测定PoIFN-α-156s和PoIFN-α对VSV和PRV的抑制作用。用细胞维持液将蛋白2倍倍比稀释后孵育细胞24h,每孔接入100 TCID50/0.1 mL VSV或PRV,收取上清检测VSV和PRV病毒的TCID50和基因拷贝数。试验结果表明PoIFN-α-1 56s和PoIFN-α均能抑制VSV和PRV病毒在Vero细胞和ST细胞上的复制,呈现剂量依赖性。用100ng/mL的PoIFN-α-156s预处理的ST细胞培养液中VSV和PRV的滴度均下降约2个滴度,VSV的基因拷贝数下降约2Log10,PRV的基因拷贝数下降约1.5Log10,相比PoIFN-α处理组。试验结果表明PoIFN-α-156s在细胞上抑制病毒复制的能力高于PoIFN-α,具有更高的抗病毒活性。3.PoIFN-α-156s抑制小鼠体内对VSV复制作用研究将雌性小鼠随机分为PoIFN-α-156s处理组、PoIFN-α处理组和阴性对照组。PoIFN-α-156s和PoIFN-α处理组的小鼠采用腹腔注射的方式注射,注射量为2.5 mg/kg,阴性对照组注射等量的生理盐水。通过眼球采血的方式在0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,12,24,36,48和72 h采集小鼠的血液,分离血清,利用猪α干扰素检测试剂盒检测干扰素在小鼠体内的代谢时间。结果表明PoIFN-α-156s在小鼠体内的代谢时间为48h,而PoIFN-α对照组的代谢时间为24h。为了验证PoIFN-α-156s是否抑制VSV在小鼠体内的增殖,将试验组分为阴性对照组、VSV感染组、VSV+PoIFN-α-1 56s组(二者同时处理组)、VSV-PoIFN-α-156s组(接种病毒1d后,蛋白再接种小鼠)。蛋白以2.5 mg/kg通过腹腔注射的方式接种小鼠,VSV病毒通过滴鼻接种200μL VSV(每只小鼠10.39Log10 GE),阴性对照组接种等量的生理盐水。试验结果表明VSV感染组的小鼠的肺部的VSV病毒含量最高,其次是脑和脊髓。与VSV感染组相比,VSV+PoIFN-α-156s组小鼠肺部在1dpi时病毒含量下降约2 Log10GE,在2dpi时下降约0.8 Log10GE;脑部和脊髓病毒含量在1dpi时下降约0.5Log10GE,在2dpi时下降约2Log10GE;表明在小鼠体内PoIFN-α-156s能有效的抑制VSV病毒复制。VSV-PoIFN-α-156s组检测结果表明在接种PoIFN-α-156s后,小鼠肺部、脑部和脊髓的VSV病毒含量在2dpi时相比VSV感染组下降约1.2 Log10GE,表明PoIFN-α-156s在VSV感染小鼠后具有抑制其增殖的作用。4.猪α干扰素与IgG-Fc融合蛋白的构建、表达、纯化及抗病毒活性的测定为了延长猪α干扰素的半衰期,将IgG-Fc片段与PoIFN-α-156s连接,构建融合蛋白并在小鼠体内验证融合蛋白的半衰期。利用融合PCR的方法扩增出融合蛋白的基因序列,并在IgG-Fc片段与PoIFN-α-1 56s之间加入“GGGGS”柔性肽。结果表明本试验成功构建了3个猪α干扰素和IgG-Fc融合蛋白,并命名为PoIFN-α-Fc、PoIFN-α-GS-Fc和PoIFN-α-2GS-Fc。在ST细胞和Vero细胞上测定融合蛋白抗病毒活性,证实本试验融合蛋白PoIFN-α-2GS-Fc具有较高的抗病毒活性:利用猪α-干扰素定量检测试剂盒对小鼠血清内干扰素蛋白的检测,结果证实PoIFN-α-2GS-Fc相比PoIFN-α在小鼠体内的代谢时间延长了约3倍。