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[目 的]进行脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的取材、分离、提纯、培养和传代,并对其进行观察和检测鉴定,研究脂肪干细胞在分化和培养增殖过程中的各方面生物学特性,研究不同次代脂肪干细胞的增殖能力和分化能力并进行对比和分析。加深对脂肪干细胞各种特性的了解,为下一步进行脂肪干细胞治疗肠瘘的实验研究奠定基础。[方 法]分离得到脂肪干细胞,并进行提纯和传代培养,通过观察形态特征和表面标记物CD29、Sca-1、CD34、CD45的流式细胞术检测对分离的细胞进行鉴定。在培养的脂肪干细胞中选取生长良好的P3、P6、P10、P15代,通过使用CCK8试剂盒检测、PI染色后流式细胞术检测和蛋白质印迹检测细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4的表达等检测ADSCs的增殖能力。选取P3、P6、P10、P15不同代次脂肪干细胞,通过成骨诱导分化后茜素红染色后观察成骨情况和QPCR检测成骨基因R unx-2、ALP和Osterix的表达情况来检测不同代次的成骨诱导分化情况。[结 果]1.取大鼠脂肪组织经分离、提纯后得到脂肪干细胞,传代培养后观察可见,传至第3代左右脂肪干细胞纯度较高,生长活跃,此时脂肪干细胞形态多梭形,呈螺旋状生长,生长过程呈S形,一般前3天处于潜伏期,4-8天呈对数期生长,8天后处于平台期。通过使用CD29、Sca-1、CD34、CD45抗体与脂肪干细胞反应后流式细胞术检测,对分离出脂肪干细胞进行鉴定,结果发现CD29、Sca-1两个蛋白均表达的细胞含量在97.567%,二者皆为阳性表达,CD34阳性细胞6.919%;CD45阳性细胞0.839%,CD34、CD45均为阴性表达。可以确定分离的细胞为ADSCs。2.使用CCK8试剂盒检测脂肪干细胞P3、P6、P10、P15不同代次细胞生长情况,显示P3和P6低代次细胞在24h、48h、72h、96h细胞增殖活性旺盛,P3代和P6代之间无明显差异,至P10代细胞增殖活性明显减弱,P15代细胞增殖活性进一步减弱。PI染色后流式细胞术检测P3、P6、P10、P15代脂肪干细胞周期分布情况,结果显示P3和P6低代次细胞G0/G1期细胞较少且明显少于P10、P15代。蛋白质印迹分析检测P3、P6、P10、P15代脂肪干细胞细胞周期相关蛋白 CyclinD1、CDK4 的表达情况,显示 P3、P6 代 CyclinD1、CDK4 低表达,P10、P15代相对表达较高。3.对P3、P6、P10、P15不同代脂肪干细胞次进行成骨诱导分化后,茜素红染色后镜下观察,可见P3、P6低代次细胞比P10、P15代骨细胞细胞数量更多。通过QPCR检测脂肪干细胞细胞P3、P6、P10、P15不同代次脂肪干细胞中成骨相关基因Runx-2、ALP和Osterix的表达,结果显示P3和P6低代次细胞中Runx-2、ALP和Osterix基因的表达明显高于P10、P15代。[结 论]1.提取大鼠脂肪组织,进行分离、提纯、培养、传代等,经观察和表面标记物鉴定确定为脂肪干细胞。2.对P3、P6、P10、P15不同代次脂肪干细胞增殖能力检测,P3、P6低代次细胞增殖活性明显高于P10、P15代。3.P3、P6、P10、P15不同代次脂肪干细胞进行成骨诱导分化检测中,P3、P6低代次细胞分化能力明显高于P10、P15代。4.从增殖活性、分化能力等方面看,脂肪干细胞中低代次细胞在增殖活性和分化能力方面更优越,可能更适合作为继续培养和进一步实验和治疗的材料。