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目的柯萨奇病毒(Coxsachievirus,CV)是一类在自然界普遍存在的病毒,属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridas),肠道病毒属(Enterovirus)。柯萨奇病毒已知有30个血清型,根据病毒对乳鼠的致病特点及对细胞敏感性的不同,将病毒分成A组和B组,B组病毒有6个血清型B1-B6,可引起特征性传染性胸肋痛,合并脑膜脑炎、心肌炎、肝炎、溶血性贫血等。其中柯萨奇病毒B3型(CVB3)侵入机体之后,主要导致病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)、脑膜炎等。从CVB3的感染动力学可得知,CVB3感染的细胞谱十分广泛,其感染性及程度的主要因素之一取决于这些细胞表面柯萨奇病毒受体与病毒的相互作用;通过分析柯萨奇病毒易感细胞与非感染细胞的差异,陆续发现了柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)、衰变加速因子(DAF)等受体。CAR几乎表达在所有体细胞的表面,可能与细胞的粘接和增殖有关,但确切的生物学功能至今还不清楚,近期发现CAR可作为柯萨奇病毒和腺病毒的共同病毒受体,才受到研究者的广泛关注。DAF也广泛表达于体内的多种细胞,早期发现DAF可作为一种补体调节蛋白,其调节补体的功能现已明确,但它作为一种病毒受体的功能却研究甚少。目前,CVB3具体的致病机制还不清楚,CVB3结合受体时,动态构象中结合位点的定位、胞内信号转导、细胞骨架的变化等均值得深入研究。在本实验中,用CAR抗体和DAF抗体干预HeLa细胞,检测在CVB3感染时CAR抗体和DAF抗体对细胞的保护作用,间接反映出CAR和DAF在CVB3入侵HeLa细胞过程中所起作用的大小;并分别在RNA水平和蛋白水平上检测CAR和DAF随病毒感染时间和浓度的变化规律。方法1、不同浓度的CAR抗体和DAF抗体对HeLa细胞的保护作用:实验分为5组:①V(virus)组:即病毒组,加入CVB3与HeLa细胞相互作用,作为阳性对照;②D(DAF抗体)组:即DAF抗体作用组,在加入CVB3之前,先用DAF抗体与HeLa细胞相互作用。③C(CAR抗体)组:即CAR抗体作用组,在加入CVB3之前,先用CAR抗体与HeLa细胞相互作用。④C+D(CAR抗体和DAF抗体)组:即CAR抗体和DAF抗体共同作用组,在加入CVB3之前,先用CAR抗体和DAF抗体共同与HeLa细胞相互作用。⑤NOR(normal)组:即正常HeLa细胞对照组,用正常的HeLa细胞做为以上各组的阴性对照。(1)MTT法检测各组细胞活性:在490nm波长下检测各组细胞光密度值(OD值),计算出各组均值、细胞相对生存率(RSR)及各组抗体对病毒的抑制率(IR)。(2)空斑计数法检测抗体对病毒毒力的影响:对各组的病毒空斑用计数器计数,并计算出各组的空斑形成单位。2、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测CARmRNA、DAFmRNA在CVB3入侵HeLa细胞过程中的表达变化:用Trizol提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察电泳结果并拍照、扫描。将凝胶电泳图条带密度进行计算机分析,计算电泳条带与β-actin扩增条带光密度值作为其相对表达强度。3、流式细胞仪检测CAR和DAF在病毒入侵HeLa细胞过程中表达的变化:CVB3与HeLa细胞相互作用后,加入CAR和DAF的荧光抗体,用流式细胞仪对二者的表达情况进行检测。结果1、MTT法检测结果:细胞生存率与抗体浓度呈正相关,在细胞的生存率方面,D组与V组相比差异无统计学意义,C组与V组相比差异有统计学意义(P＜0.05),C+D组与V组相比差异有显著统计学意义(P＜0.01)。在对病毒的抑制率上,C+D组对病毒的抑制效果最好,且在抑制效果上C组+D组＜C+D组。2、空斑计数法检测结果:由于抗体的封闭作用,CVB3病毒的毒力有所下降,致病性减弱。在病毒空斑减少程度上以C+D组最为显著。3、RT-PCR和流式细胞仪检测结果显示:在CVB3作用于HeLa细胞后,CAR和DAF的表达出现上调,上调水平与正常对照组相比有显著统计学意义(P＜0.01)。1h之后,DAF的表达恢复正常,CAR仍维持在较高水平。并且CAR和DAF的上调幅度与CVB3的浓度成正相关。结论在CVB3侵入HeLa细胞过程中,作为病毒受体的CAR与DAF相比起到更为主要的作用,且CAR和DAF可能具有一定的协同作用。CVB3的侵入会上调DAF和CAR在细胞表面的表达,且上调程度与CVB3的浓度呈正相关。CVB3在侵入细胞后,细胞表面DAF的表达迅速下调,这可能与病毒逃避免疫监视有关。