微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,能广泛寄生于包括人在内的所有动物,目前已报道的微孢子虫有150个属,1400多个种。作为最早发现的微孢子虫——家蚕微孢子虫,能感染经济昆虫家蚕引发家蚕微粒子病,攻克微粒子病一直是蚕业界的重点和难点。然而对于家蚕微孢子虫研究基础的薄弱,成为了攻克这一难关的瓶颈。转座子是基因组中可以从一个位点转移至另一个位点并进而影响到与之相关的基因功能的遗传因子,它广泛分布于真菌、植物、昆虫、鱼类和哺乳动物等,是基因组内突变的主要原因之一。反转座子是其中的一类,其在增殖和转座时必须以RNA为中间产物,以DNA-RNA-DNA的方式进行。目前已经在许多物种中发现了反转座子,但是微孢子虫相关的报道很少,本实验室曾经报道了8条完整的家蚕微孢子虫LTR反转座子—Nbr。本研究利用蛋白质组学的方法、RT-PCR法等,对于家蚕微孢子虫中是否存在具有活性的反转座子进行了探讨,为进一步开展家蚕微孢子虫的进化分析、基因功能的鉴定等奠定了基础。1.蛋白质组学方法鉴定家蚕微孢子虫的活性反转座子利用双向电泳技术分离家蚕微孢子虫总蛋白质,切胶获得71个蛋白质点,经过质谱分析鉴定出28个蛋白质,其中有4个注释为Pol蛋白。Pol是它的一个ORF,编码多聚蛋白。继已报道的8个Nbr,将它们分别命名为Nbr5(为已报道的)、Nbr9、Nbr10、Nbr11。这4个Pol蛋白分布在基因组不同的scaffold上,氨基酸长度分别为625aa、165aa、372aa、267aa,分子量分别为34kD、19kD、49kD、31kD。通过在NCBI上BLASTP分析发现它们是反转座子Pol ORF中的一段基因,编码一种或几种反转座酶。2.RT-PCR方法验证家蚕微孢子虫反转座子的活性由于MALDI-TOF-MS的方法不能获得氨基酸序列,有一定的局限性,本研究进一步运用RT-PCR对该4个Pol多聚蛋白在家蚕微孢子虫体内的转录活性进行研究。采用感染家蚕微孢子虫第10天的家蚕中肠提取RNA,并反转录为sscDNA作为模板,结合Pol蛋白特异性引物做RT-PCR,扩增出了相应的目的条带。通过RT-PCR进一步验证了蛋白质组学方法获得的4个Pol具有转录活性。3.家蚕微孢子虫EST库中活性反转座子的鉴定从纯化的家蚕微孢子虫中提取总RNA,构建EST数据库。在其中检索到了3条注释为pol多聚蛋白的EST序列,分别命名为Nbr12、Nbr13、Nbr14。BLASTP注释的期望值都在5.00E-72以上、同源性大于87%,EST长度大于300bp,检索结果可信,表明这3个Pol多聚蛋白基因在家蚕微孢子虫中具有转录本。4.家蚕微孢子虫活性反转座子的生物信息学分析将鉴定的7个具有转录活性的Pol多聚蛋白两端延伸4000bp,结合生物信息学的方法,找出完整的LTR反转座子。对其进行序列特征分析,发现家蚕微孢子虫基因组内LTR反转座子的结构存在多样性。LTR具有多态性,其长度为26～306bp不等。ORF也存在不完整的情况,Nbr11的头部序列缺失,不存在Gag和Pro结构域,RT结构域也不完整;Nbr10的Pro结构域缺失;Nbr9的RT结构域也是不完整的;而Nbr12的RT结构域存在有1026bp的插入序列。虽然存在结构上的不完整,但一些保守基序仍然是存在的:Nbr10和Nbr13具有Cys基序(CX2CX4HX4C),而Nbr12则有一个类似前者的基序(CX2HX4HX4C);Nbr12、Nbr13、Nbr14的Pro结构域具有保守的D(T/S)G基序;而对于RT结构域,7个反转座子都存在YXDD基序;在它们的RH结构域中,除Nbr5和Nbr13具有的是类似DAS基序的DAC外,其他的反转座子都存在该保守序列。检索发现7个LTR反转座子的拷贝数都很低(1～10),而且拷贝间具有比较大的异质性(如Nbr14的Pi值为0.4280),推测认为这些反转座子进入家蚕微孢子虫基因组的年代可能比较久远,而且存在着丢失现象。当然,我们也发现除Nbr13外的其他家族都存在着同源性很高的拷贝(＞92%),认为近期转座事件仍在发生着,也从另一方面支持了它们是具有活性的。而Nbr13只有一个拷贝,可能就是由于序列变异程度太大,不能被检索出来。这些LTR反转座子与已经报道的8个Nbr相似,具有Ty3/gypsy群的特征(INT结构域位于RT结构域的3’端),也通过系统进化分析证明了这一分类,推测家蚕微孢子虫基因组中的所有LTR反转座子是来源于某一个Ty3/gypsy群的共同祖先。此外,进化树也将14个Nbr分成了两枝,活性未知Nbr的一枝与真菌Ty3反转座子聚为一簇,而另一枝是本文鉴定有活性的,它们与实蝇Yoyo反转座子聚在一起。以前研究认为Nbr对基因组的作用不大,它们多是与其他转座元件成簇排列在一起,然后特异的插入共线性区域之间,不干扰基因组的正常排布。而我们除发现成簇聚集现象外(Nbr5),还发现了插入共线性区域内的Nbr11及其引起的基因组片段倒置现象,进一步分析发现它的Ka/Ks＞1,具有正向的进化压力,推测认为它的转座及引起的片段倒置适应了基因组的要求而被接受了下来。由此说明,家蚕微孢子虫中的反转座子对在基因组重排、进化起到积极的作用。结论:通过蛋白质组学方法鉴定、RT-PCR验证、EST库搜索,在家蚕微孢子虫中共发现了7个具有活性的Pol多聚蛋白,利用生物信息学分析确定它们都是完整LTR反转座子的一部分,从而推断这些反转座子也是具有活性的。然后对这些反转座子进行相关生物信息分析,发现它们与之前已经报道的Nbr属于同一群体,拷贝数不高,各家族成员间却有较大的异质性。这些反转座子或是与转座酶聚集或是插入到共线性区域,认为它们是造成家蚕微孢子虫基因组增大、重排、进化的一个重要因素。