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随着现代化进程的不断推进,环境污染给动物和人类健康带来的危害日益凸显,这已成为人们普遍关注的社会问题。环境污染物能够通过多种途径(如饮水等)进入动物和人体内,进而造成自身生理功能异常。双酚芴(BHPF)是双酚A(BPA)的替代物之一,用于生产所谓的“不含BPA”的塑料产品。最新研究发现,双酚芴可以通过水体进入人和小鼠体内并能产生抗雌激素效应,这些实验结果表明双酚芴可能会对生物体健康产生危害。然而,关于双酚芴对雌性动物卵母细胞减数分裂成熟的影响尚未见报道。因此,本试验以小鼠和猪为实验动物,通过小鼠卵母细胞和猪卵丘卵母细胞复合体(COCs)体外培养过程中添加不同浓度的双酚芴,以探究双酚芴对卵母细胞体外成熟的毒性影响。本研究首次报道了双酚芴对雌性动物卵母细胞成熟的毒性效应,提出了双酚芴的安全性问题仍然值得人们探讨,为揭示双酚芴对动物乃至人类生殖健康存在的潜在危害提供理论线索,也为指导双酚芴在工业上的合理应用提供理论依据。研究内容分为两部分,主要结果如下:一、双酚芴对小鼠卵母细胞体外减数分裂成熟的影响研究小鼠卵母细胞成熟培养液中添加不同浓度的双酚芴(0、50μM、100μM和150μM),体外培养卵母细胞2 h和12 h时分别观察并统计减数分裂恢复(GVBD)和第一极体排放(PBE)率。结果显示,双酚芴(100μM和150μM)可以显著抑制GVBD和PBE的比率(P<0.01)。双酚芴(100μM和150μM)处理小鼠卵母细胞2 h和12 h后,检测细胞活性。结果发现,双酚芴可以显著降低卵母细胞内ATP水平(P<0.05和P<0.01)。100μM双酚芴处理小鼠卵母细胞7.5 h后,运用免疫荧光染色(IF)、实时定量PCR、荧光强度测定和western blot(WB)等分析方法检测减数分裂进程中关键的调控因子和事件。结果发现,双酚芴可以导致小鼠卵母细胞内纺锤体组装异常(P<0.01)、微丝构建紊乱(P<0.01)、线粒体功能异常(线粒体分布异常和线粒体DNA拷贝数缺失,P<0.01)、线粒体自噬发生(PINK1、Beclin1和LC3B表达上调以及TOMM20和TIMM17A表达下调;P<0.01)、ROS水平升高(P<0.05)、早期凋亡发生(P<0.01)和H3K9me3、H3K27me3水平升高(P<0.01)。二、双酚芴对猪卵母细胞体外减数分裂成熟的影响研究猪卵母细胞成熟培养液中添加不同浓度的双酚芴(0、25μM、50μM和75μM),体外培养COCs 44 h时,观察卵丘扩展并统计卵母细胞第一极体排放率。结果发现,双酚芴(50μM和75μM)可以显著抑制卵丘颗粒细胞扩展,降低猪卵母细胞第一极体排放(PBE)率(P<0.05),抑制猪卵核成熟。50μM双酚芴处理猪COCs 27 h后,脱去卵丘颗粒细胞,运用细胞活性检测、免疫荧光染色(IF)和荧光探针染色等方法检测减数分裂进程中关键的调控因子和事件。结果发现,双酚芴可以诱导猪卵母细胞内纺锤体组装异常(P<0.05)、ATP水平下降(P<0.05)、活性氧簇(ROS)水平上升(P<0.05)、早期凋亡发生(P<0.05)和皮质颗粒分布异常(P<0.05)。此外,为了探究褪黑素对双酚芴诱导的极体排放失败是否有缓解作用,我们采用了一定浓度的褪黑素(10-500μM)和50μM双酚芴的共同添加处理,体外培养COCs44 h后,观察并统计PBE情况。结果显示,与50μM双酚芴处理组相比,褪黑素的添加并未显著提升卵母细胞的极体排放率(P>0.05)。综上所述,一定浓度的双酚芴能够显著抑制小鼠和猪卵母细胞的体外减数分裂成熟,可通过造成卵母细胞内纺锤体组装异常、微丝构建紊乱、线粒体功能异常、ATP水平下降、ROS水平升高和早期凋亡发生等干扰第一极体排放。此外,双酚芴还可以通过改变卵母细胞内组蛋白修饰水平和皮质颗粒分布从而影响卵母细胞质量。