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九叶青花椒（Zanthoxylum armatum var.novemfolius,Z.armatum）为芸香科花椒属竹叶花椒（Zanthoxylum armatum DC.）的栽培变种,因其特殊的香味特征以及药食用途,已成为一种重要的经济树种,而其树体遍布大量皮刺,严重制约了九叶青花椒产业的发展。皮刺一直是椒农在栽培管理过程中比较棘手的问题,科研工作者希望通过培育少刺或无刺的花椒品种从根本上解决此问题。目前,育种者主要是通过引进优良品种以及嫁接等无性繁殖方式获得少刺或无刺花椒品种,但无性繁殖方式不易于推广,而引进优良品种进行种子繁殖时存在严重返祖现象,即后代会表现出祖先有皮刺表型,无法得到稳定遗传的少刺或无刺品种,且有关花椒皮刺发育的分子机制研究报道较少。据此,本研究通过三代全长转录组测序以及二代转录组测序,构建了九叶青花椒（有皮刺）和荣昌无刺花椒（无皮刺）不同发育时期叶片的高质量全长转录本数据库,为花椒性状的研究提供高质量的参考基因资源;基于比较转录组测序分析结果,挖掘了花椒皮刺发育和形成过程中的关键基因,并对关键基因进行了功能验证,解析了花椒皮刺形成的潜在分子机制。项目研究结果为通过基因工程手段培育少刺或无刺花椒品种奠定了理论基础。本研究主要结果如下:（1）本研究以九叶青花椒和荣昌无刺花椒三个不同发育时期的叶片（发芽后10天、60天、120天的叶片）为材料,利用Pac Bio平台进行全长转录组测序,荣昌无刺花椒获得16.26 Gb的干净读数（Clean reads）、533,462插入（ROI）序列、392,116条全长非嵌合序列（FLNC）;九叶青花椒获得15.22 Gb的干净读数、456,134条插入序列、355,210条全长非嵌合序列。聚类分析分别在荣昌无刺花椒和九叶青花椒中获得208,933和187,358条一致性转录本序列。构建了荣昌无刺花椒和九叶青花椒三个不同发育时期的转录组数据库,共获得117.65 Gb的Clean reads,二代测序数据校正后分别获得137,429和130,588条高质量转录本序列;对所有高质量转录本以及矫正后的转录本进行去冗余分析,共得到148,445转录本序列。序列结构分析预测出105,465条简单重复序列（SSR）、114,205条完整的编码区序列和4,719条lncRNAs,且从荣昌无刺花椒和九叶青花椒分别预测到6,647和3,795个可变剪切事件（AS）。结合三代转录测序和二代转录组测序数据,在不同比较组之间共鉴定了96,931个差异表达基因（DEGs）,其中94,341个DEGs被注释到公共数据库。为了解植物激素在花椒皮刺形成过程中的作用,本研究测定了样品中的生长素、细胞分裂素、茉莉酸和脱落酸的含量,九叶青花椒叶片中茉莉酸、生长素和细胞分裂素的含量显著高于荣昌无刺花椒叶片中的含量,而脱落酸的含量无显著差异。根据高质量转录本数据以及基因注释信息,筛选到1,560 DEGs可能参与调控生长素、细胞分裂素、茉莉酸和脱落酸代谢过程。基于1,560 DEGs的表达水平以及样本中激素含量,采用加权基因共表达网络分析,鉴定出8类基因（MYC、IAA、ARF、CRE/AHK、PP2C、ARR-A、AOS和LOX）,25个转录本,可能影响生长素、细胞分裂素和茉莉酸的代谢过程,从而间接参与九叶青花椒皮刺的形成过程。其中生长素代谢途径中的ARF5.2发生了AS事件,且25条基因中有20个基因受到69条lnc RNAs的调控,表明AS事件和lnc RNA可能参与调控九叶青花椒皮刺的发育。上述研究结果表明,全长转录组SMRT测序和Illumina RNA测序的联合分析可以在缺乏参考基因组信息或基因组信息不完整的条件下最大程度掌握物种的遗传信息,以及在阐明植物生命活动相关遗传调控机制方面发挥重要作用。（2）转录因子参与植物表皮毛发育过程,为鉴定花椒中参与皮刺发育的关键转录因子,本研究筛选出217个差异表达的转录因子,包括170个MYB、9个b HLH和38个HD-ZIP转录因子,关联分析其他植物物种中成功报道的转录因子基因,确定了与九叶青花椒皮刺形成相关的8个关键候选转录因子基因,包括6个MYBs、1个GL3和1个GL2。生物信息学分析表明,8个蛋白均为不稳定、无跨膜区域亲水性蛋白,均具有丰富的磷酸化位点。保守结构域分析结果表明,MYB1、MYB2、MYB3、MYB4和MYB5属于R2R3型MYB转录因子,GL3属于HD-ZIP转录因子基因家族,GL2属于b HLH转录因子基因家族,并对8个基因在不同组织样中的表达模式进行了分析,均有组织特异性。（3）开展九叶青花椒皮刺形成关键候选转录因子基因的功能研究,发现Za MYB86基因在突变体拟南芥中异源过表达,过表达转基因拟南芥叶片较小,且表皮毛数量明显减少,表明Za MYB86基因抑制拟南芥表皮毛的发育,推测Za MYB86可能是九叶青花椒皮刺发育的负调控因子。为解析Za MYB86调控九叶青花椒皮刺潜在的分子机制,本研究利用在线网站预测了与Za MYB86发生互作的蛋白,并利用酵母双杂交以及双分子荧光技术验证,结果发现Za MYB86与Za MYB5蛋白之间存在互作。比对发现Za MYB5与拟南芥At MYB5的MYB DNA结合结构域高度相似,表明Za MYB5与At MYB5蛋白可能具有相同的生物学功能,有研究报道表明At MYB5基因具有负调控拟南芥表皮毛发育的功能,进一步推测Za MYB5是花椒皮刺形成的负调控因子。综上所述,本研究提出Za MYB86与Za MYB5相互作用,共同参与调控九叶青花椒皮刺形成的潜在分子机制。