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尽管大量的研究工作和经费投入试图阐明疼痛机制，对疼痛调节和吗啡镇痛作用耐受性的传统认识仍然停留在以外周和中枢神经元为中心的疼痛通路上。最近的研究表明，脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞的激活对慢性疼痛和吗啡耐受的调节起着至关重要的作用。然而，胶质细胞参与慢性疼痛和吗啡耐受的具体调节通路和作用机制仍不完全清楚。我的博士课题主要研究脊髓胶质细胞治疗慢性疼痛和吗啡镇痛耐受新靶点分子及其通路的生物学，包括发现和验证脊髓背角小胶质细胞胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）/β-内啡肽抑制性通路参与慢性疼痛调节和脊髓背角星形胶质细胞D-型氨基酸氧化酶（DAAO）/过氧化氢（H2O2）通路参与慢性疼痛和吗啡镇痛耐受性的调节。 DAAO是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的经典黄素酶，在脊髓背角几乎仅存在于星形胶质细胞中，可选择性地催化中性和极性D-型氨基酸包括D-型丝氨酸生成相应的α-酮酸、NH3和H2O2。H2O2是一种低反应性但相对较稳定的活性氧类物质（ROS），可能是 ROS的一种重要的最终存在形式。前期研究表明DAAO基因突变能降低福尔马林诱导的持续性疼痛，本课题通过研究一系列化学结构不同的DAAO抑制剂包括CBIO、“Compound8”、AS057278和苯甲酸钠在福尔马林诱导的疼痛模型中的作用，发现脊髓给予DAAO抑制剂能特异性地阻断福尔马林诱导的持续性疼痛，但对急性疼痛不影响。DAAO抑制剂体外抑制DAAO活性和体内阻断福尔马林诱导的慢性疼痛的效价顺序为：CBIO>“Compound8”>AS057278>苯甲酸钠，且其体外抑制活性与其体内镇痛作用效价呈正性相关。DAAO抑制剂阻断福尔马林诱导的持续性疼痛最大抑制率约60％，说明福尔马林诱导的慢性疼痛60%是“DAAO敏感型”，其他40%和急性疼痛是“DAAO不敏感型”。 以CBIO为代表的DAAO抑制剂与吗啡急性镇痛在急性疼痛（包括福尔马林诱导的急性疼痛，热板和甩尾疼痛模型）和福尔马林诱导的慢性疼痛均具有相加作用。长期7天连续皮下给予CBIO不产生镇痛作用的自身耐受性以及与吗啡镇痛作用的交叉耐受性，而长期7天连续皮下给予吗啡产生镇痛作用自身耐受性，但不与CBIO产生交叉耐受。 我们还发现，在福尔马林疼痛、热板和甩尾疼痛模型中，全身和脊髓给予DAAO抑制剂CBIO、AS057278和苯甲酸钠能剂量依赖式地并完全预防和阻断吗啡镇痛作用耐受性，且与其体外抑制DAAO活性呈正性相关。脊髓给予DAAO基因沉默剂siRNA/DAAO和shRNA/DAAO均能几乎完全预防吗啡镇痛作用耐受性的形成。脊髓给予CBIO和siRNA/DAAO能完全阻断吗啡耐受引起的H2O2的升高。同时，脊髓给予非选择性H2O2清除剂PBN和特异性过氧化氢催化剂catalase亦能阻断已形成的吗啡耐受。我们还进一步证实DAAO特异性地表达在脊髓背角星形胶质细胞上，吗啡耐受能显著活化星形胶质细胞并上调DAAO的表达。 综合本课题研究结果以及前期研究和最新进展，表明脊髓背角星形胶质细胞DAAO/H2O2通路参与中枢敏感化介导的慢性疼痛和吗啡耐受的发生和发展，证明DAAO是一个治疗慢性疼痛和吗啡耐受的新的潜在性靶点分子。值得一提的是，DAAO抑制剂治疗慢性神经源性疼痛的临床研究已经开展。通过阐明DAAO抑制剂与吗啡在镇痛作用中复杂的相互关系，为吗啡和DAAO抑制剂在临床联合用药提供了药理学基础。 GLP-1受体是一个B1族G蛋白偶联受体，参与血糖调节，其主要信号通路由钙离子和cAMP/PKA等介导。GLP-1受体经典的激动剂包括能迅速被二肽基肽酶-4（DPP-4）降解的内源性GLP-1(7-36)和长效型结构类似物exenatide。GLP-1，exenatide和DPP-4抑制剂目前已用于临床治疗II型糖尿病，由于激动GLP-1受体不产生低血糖并能减少心血管疾病的风险，直接或间接作用于GLP-1受体的药物是目前治疗糖尿病的最佳药物选择之一。我们在研究GLP-1受体激动剂exendins的血糖调节作用的过程中意外发现GLP-1受体激动剂对慢性疼痛具有较强的镇痛作用。在本课题研究中，我们深入阐明并表征了脊髓背角小胶质细胞GLP-1R/β-内啡肽抑制通路在慢性疼痛中的作用。 脊髓给予GLP-1受体激动剂GLP-1(7-36)和exenatide能剂量依赖式地抑制福尔马林诱导的II相持续性疼痛、神经源性疼痛、肿瘤疼痛和糖尿病疼痛达60-90%，而不影响急性疼痛，这种抑制作用能被特异的GLP-1受体拮抗剂和基因沉默剂完全阻断。GLP-1受体激动剂引起的抑制慢性疼痛的作用是通过cAMP/PKA信号通路介导，长期给予GLP-1受体激动剂不产生镇痛作用耐受性。GLP-1受体特异性地表达在脊髓背角的小胶质细胞上，GLP-1受体的表达在神经源性疼痛的手术侧脊髓背角被显著上调。Exenatide能刺激脊髓背角和体外培养的小胶质细胞释放β-内啡肽，且其镇痛作用能被小胶质细胞活化抑制剂、β-内啡肽抗体和阿片受体阻断剂完全阻断。这些研究结果表明激动特异性表达在脊髓背角小胶质细胞上的GLP-1受体在慢性疼痛模型产生高效镇痛作用，该作用是完全通过释放内源性β-内啡肽介导，但不产生镇痛耐受。该研究深入阐明并表征了脊髓背角小胶质细胞GLP-1R/β-内啡肽抑制通路在慢性疼痛中的特点，为开发治疗针对脊髓GLP-1受体治疗慢性疼痛新药提供了神经生物学基础。 本课题随后研究了GLP-1受体小分子激动剂京尼平苷及其衍生物的镇痛作用。京尼平苷能浓度依赖式地完全保护过氧化氢对表达大鼠GLP-1受体的PC12细胞和表达人GLP-1受体的HEK293细胞的氧化应激损伤，该作用与exenatide相似但活性较低。GLP-1受体正构位点拮抗剂exendin(9-39)能平行右移京尼平苷对氧化应激损伤保护的量效关系曲线且不影响最大有效率，对表达大鼠和人GLP-1受体的两种细胞的pA2值几乎相同。脊髓、皮下和灌胃给予京尼平苷能剂量依赖式地阻断福尔马林诱导的II相慢性疼痛，对I相急性疼痛不影响，最大抑制率为80%的左右，然而侧脑室和痛受体周围给予京尼平苷不影响福尔马林疼痛。7天连续给予京尼平苷和exenatide亦不产生耐受。脊髓给予京尼平苷产生的镇痛作用能完全被exendin(9-39)、GLP-1受体基因沉默剂和cAMP/PKA信号通路抑制剂所阻断。与京尼平苷结构类似的环烯醚萜类化合物京尼平苷酸、京尼平、甲基京尼平、1,10-anhydrogenipin、loganin和梓醇均能保护过氧化氢诱导的氧化应激损伤，脊髓给予亦能抑制福尔马林诱导的II相慢性疼痛，这类化合物在体内和体外与exenatide相似的生物学作用均能被exendin(9-39)完全阻断。该研究结果表明以京尼平苷为代表的环烯醚萜类化合物能特异性地阻断福尔马林诱导的II相慢性疼痛，该作用是由于激动了脊髓GLP-1受体产生的。环烯醚萜类化合物口服有效，是一类对大鼠和人GLP-1受体均产生激动且结构新颖的正构型GLP-1受体激动剂，可能与exendin(9-39)具有相同的结合位点，且具有完全的激动活性。京尼平苷为代表的环烯醚萜类化合物的镇痛作用是完全由激动GLP-1受体介导。这些环烯醚萜类化合物包括临床有效治疗慢性疼痛的藏药独一味有效成分山栀子苷甲酯和8-O-乙酰基山栀子苷甲酯，从而导致独一味作用机制的阐明。 本课题研究阐明了脊髓背角胶质细胞参与调控慢性疼痛和吗啡耐受两个新的通路，即DAAO/H2O2和GLP-1R/β-endorphin通路，为胶质细胞参与调节慢性疼痛、吗啡镇痛耐受以及其他可能的神经生物学功能（如神经保护作用和精神分裂症）提供了新知识和理论。如我们的研究首次证明激活脊髓小胶质细胞不仅释放致痛的炎性因子同时释放镇痛的神经肽，对疼痛具有双重调节作用。我们的研究还对DAAO在精神分裂症中作用的新机制提供了借鉴，即可能由DAAO产生的H2O2介导。