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免疫磁珠(Immunomagnetic Beads,IMB)是表面包被有抗体(或配体)的磁性微球。能特异性吸附抗原(受体)等物质,目前已广泛应用于生物和医学等领域。本研究利用化学共沉淀法合成磁珠,再将抗GST标签蛋白偶联到改性后的磁珠表面,免疫试验动物制备大量鸡抗GST多克隆抗体,与此同时验证其免疫佐剂效应。将GST多抗包被磁珠,制备得到IMB-GSTAb,然后用IMB-GSTAb捕获GST-VP2(禽法氏囊病毒VP2抗原)、GST-HN(禽新城疫HN抗原)融合蛋白,用于免疫实验动物鸡,探索新基因工程纳米疫苗免疫增强作用和免疫保护力。动物实验证明IMB具有一定的免疫增强作用和良好的生物安全性。本研究为寻找一种操作简便、安全有效且价格低廉的新型纳米佐剂提供了参考,同时也为禽主要疾病的疫苗生产及防控提供了新的思路。1.鸡抗GST多克隆抗体的制备培养含GST表达载体(pGEX-KG)的大肠杆菌BL21,收获GST蛋白。过Sepharose4B柱子纯化得到的GST蛋白,包被于自制磁珠的表面,免疫2周龄艾维因鸡,ELISA检测血清效价达1.6×104,证明自制磁珠具有免疫增强作用。采血得到鸡血清,按辛酸-硫酸铵法提纯鸡抗GST多克隆抗体。Western blot试验证明自制GST多抗具有生物学活性和特异性。2. IMB-GSTAb的制备采用化学共沉淀法合成Fe304纳米粒子,并对其表面进行修饰,使其表面带有-CHO基团,得到平均粒径在50-100nm之间并具有超顺磁性的磁珠,改性后磁珠的浓度为5.5mg/mL将磁珠与GST抗体偶联制备IMB-GSTAb,用IMB-GSTAb捕获GST-VP2、 GST-HN融合蛋白。通过控制和改变缓冲介质、溶液pH值、反应时间和温度等参数,优化磁珠偶联抗体的条件。通过用紫外分光光度计测定反应前后溶液中蛋白浓度,对磁珠偶联抗体的效果进行评价,确定偶联抗体的最佳条件为0.1MTBS(pH6.0)缓冲液,37℃混匀仪中孵育3h；捕获极值为45-50μg/mg;封闭IMB的最佳条件为5%脱脂奶粉,37℃混匀仪中封闭2h；IMB-GSTAb捕获GST-VP2融合蛋白的最佳反应条件为0.01MPBS(pH7.4)缓冲液,37℃混匀仪中孵育1h,捕获极值为15μg/mg; IMB-GSTAb捕获GST-HN融合蛋白的最佳反应条件为0.01MPBS(Ph6.8)缓冲液,37℃混匀仪中孵育1h,捕获极值为12μg/mg。3.禽用磁珠纳米疫苗的应用用捕获GST-VP2(B组)和GST-HN (E组)的IMB免疫1周龄鸡,同时设对照组,分别为GST-VP2组(A组)、GST-HN组(D组)、法氏囊病毒灭活苗组(C组)、新城疫病毒灭活苗组(F组)和PBS组(G组),每组5只,于四免疫后翼下静脉采血,ELISA方法测定血清中抗体水平,结果显示,B组与A组存在极显著差异,与C组无显著差异；E组与D组抗体效价水平存在显著差异,与F组无显著差异。证明自制的磁珠纳米疫苗具有一定的免疫效果。