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羧酸酯酶(EC3.1.1.1)，是指主要催化水解羧基类化合物的一类酯酶，已有的研究表明，E.coli羧酸酯酶BioH在大肠杆菌生物素合成途径中起到了非常重要的作用。从大肠杆菌K12菌株中克隆得到羧酸酯酶BioH，测得野生型的BioH水解对硝基苯丁酯(p-NPB)的活性为18U/mg，且该酶具有良好的热稳定性。 同时对该酶的进一步研究发现，其在有机相中能维持很好的活性，而且能够有效拆分二级醇和二级胺，BioH对1-苯乙醇的手性拆分研究表明在优化过的反应条件下，其对于1-苯乙醇的催化活性为12.8U/mg，反应25h时底物对映体过量值(eep)为88％。对于1-苯乙胺的催化活性为3.5U/mg，48h时底物对映体过量值(eep)为40％。而二级醇和二级胺的单体对映体是化学合成中重要的手性中间体，具有良好的工业应用价值。因此，进一步提高该酶在有机相中的反应活性，提高该酶对于这两类底物的转化速率，具有重要的研究意义。 以往的研究表明羧酸酯酶的水解反应与酰化反应都发生在其催化三联体Ser-His-Asp的活性中心，这两个反应之间存在着很大的关联，鉴于酰化反应的高通量筛选方法很难建立，而水解反应的高通量筛选方法则能很方便的建立，我们希望能通过提高BioH的水解活性来提高它的酰化反应活性。 本文以p-NPB为底物，进行高通量筛选，p-NPB水解后产生黄色的对硝基苯酚(p-NP)，可用酶标仪在405nm吸收波长下进行高通量筛选。通过两轮的定向进化过程，成功筛选到7个水解活性提高的突变体，他们的活性提高了20％-100％不等。结构分析表明突变体的突变位点均分布在远离活性中心的位置。通过测定不同突变体的蛋白表达量和热稳定性，探讨了定向进化过程中突变体亲本的选择问题，选择对蛋白表达量影响最小及使热稳定性下降最少的突变体作为下一代的亲本将有助于突变体库的筛选。 将这些突变体应用于酰化反应的活性检测中，发现了3个酰化活性提高的突变体，他们分别为K213E的酯化1-苯乙醇的反应活性提高29％，Q70L/M170T和K213E/M197L的酰胺化1-苯乙胺的活性提高40％和45％，将这些突变体中的突变点视为酰化反应的热点(hotspots)进行定点组合突变，得到了活性进一步提高的突变体，其中活性提高最大的突变体为Q70L/K213E，其酯化1-苯乙醇的反应活性提高了70％;Q70L/M197L/K213E，其酰胺化1-苯乙胺的反应活性提高了120％。 本文通过筛选提高羧酸酯酶BioH的水解活性，成功获得了酰化活性提高的突变体，这一方法，为那些难以建立高通量筛选方法的反应提供了通过体外定向进化的可能性。