虾夷扇贝MyTRAF6基因的克隆、启动子及表达分析

来源 :辽宁师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lsw19880811
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虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)是一种重要的经济贝类,广泛分布在朝鲜半岛北部,日本北部岛屿的沿岸,北方四岛以及库页岛。自1982年虾夷扇贝从日本引进到中国以来,虾夷扇贝的养殖业的发展迅速。几年来,由于近亲繁殖、海水污染和放养密度增加,爆发了虾夷扇贝的大量死亡。这不仅给虾夷扇贝的养殖业带来巨大的经济损失,也严重影响了水产养殖的稳定发展。肿瘤坏死因子相关受体因子6(TRAF6)是肿瘤坏死因子家族和Toll-like/interleukin-1家族的重要接头分子。在先天性免疫和获得性免疫中起着重要的作用。确定虾夷扇贝的TRAF6基因(本文命名为:MyTRAF6)并对其特点进行研究。利用3′RACE扩增出MyTRAF6基因的cDNA全长有2407bp,其中包括239bp的5′非编码区;1974bp的开放阅读框,编码了657个氨基酸;194bp的3′非编码区,包括多腺苷酸化信号序列AATAAA和一个poly(A)尾巴。MyTRAF6的氨基酸序列包括一个环形锌指、两个TRAF-型锌指和一个MATH(meprin and TRAF homology)结构。多序列比对结果发现,与海湾扇贝的TRAF6相似度最高达到96%;与火鸡的TRAF6相似度最低仅有43%。系统发生树能够清楚发现MyTRAF6的同源性。采用基因组步移(Genome Walking)的方法确定了MyTRAF6的启动子区域,全长为1462bp。通过TRANSFAC和AliBata2.1软件预测出MyTRAF6启动子序列中的假定转录因子结合位点。利用多序列比对方法比对了15个虾夷扇贝MyTRAF6的启动子序列发现了3个SNP位点,分别为615(C/G),553(T/C)和419(G/A)。615C/G和419G/A特定的等位基因,转录因子结合位点的没有变化。553T/C特定的等位基因,一个假定的转录因子结合位点出现在特定的T等位基因,但是不存在于特定的C等位基因。利用实时定量PCR(Real-time PCR)技术检测MyTRAF6基因在不同组织和鳗弧菌(Vibrillo anguillarum)注射后各时间段的相对表达量。结果发现MyTRAF6在血细胞中的表达量最高;鳗弧菌注射6h后,MyTRAF6在血细胞中的转录水平达到最大值。根据结果可以推测:虾夷扇贝在抵御细菌感染时,MyTRAF6起着重要的作用。可能是软体动物先天性免疫的调节分子。本实验加深了我们对虾夷扇贝的先天性免疫的理解,同时离我们找到一种对付虾夷扇贝养殖疾病的方法的最终目标更近一步。
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